внутрибрюшинно вводят цельную кровь испытуемого животного. При наличии в пробе крови вируса у овцы развивается инфекция, сопровождающаяся образованием вирусспецифических антител. Антитела у зараженных овец выявляют в РИД через 3-6 недель (Stear V.J., Dimmock C.K. 1988).
Заражение животных ВЛКРС сопровождается выработкой антител к структурным белкам вируса. Антитела и вирус персистируют в организме у зараженных животных на протяжении всей жизни. Это позволяет применять серологические методы для диагностики инфекции, вызываемой этим вирусом.
Разработанная и широко применяемая в ветеринарных лабораториях страны реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД) с использованием антигена ВЛ в настоящее время остается основным диагностическим методом, по результатам которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах (Т.С. Костенко и др., 1989, А.Г. Берзяк, В.С. Ковалючко, В.С. Гротевич, Л.И. Киричук, 1990). В действующих в настоящее время Правилах по профилактике и борьбе с лейкозом КРС приоритет отдается именно серологическим исследованиям сыворотки крови. По их результатам судят об инфицированности животных вирусом лейкоза. В зависимости от этого определяют мероприятия по оздоровлению.
К серологической диагностике лейкоза в стране приступили с 1985 года. При этом ежегодно увеличивается число животных, подвергаемых серологической диагностике. Во многих хозяйствах, даже с высоким уровнем инфицированности, этот метод хорошо себя зарекомендовал, а его использование позволило полностью оздоровить стада (Г.А. Симонян, 2007). Однако РИД – исследованиями проверяется по многим регионам около 50% поголовья. Лишь в Архангельской, Курганской, Ленинградской, Вологодской, Пермской, Удмуртской и Московской областях проверяются все животные. Низкий охват поголовья серологическими исследованиями в других регионах означает, что нет полной ясности об уровне инфицированности стада, а значит, нет четких планов оздоровления (М. И. Гулюкин и др., 1999). Кроме этого, наличие у лейкоза латентной стадии (стадии, когда в крови отсутствуют антитела к вирусу) усложняет диагностику заболевания. Экспериментально установлено, что после заражения скрытый период инфекции (период от момента заражения до появления антител к вирусным антигенам) продолжается от 2 х недель до нескольких месяцев (A. Burny, Bruck C., Cleuter Y., 1985) по этому, постепенно выводя из стада РИД – позитивных животных, теоретически возможно добиться полного оздоровления хозяйства от лейкоза (Е.А. Маринин, А.П. Кузнецов, 1996). Тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев, или даже лет выделяют животных с антителами к ВЛКРС (В. М. Нахмансон, 1986). Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования. Иммунологическая толерантность – это частичная или полная утрата способности организма вступать в иммунную реакцию со специфическими антигеном. При лейкозе КРС состояние толерантности может развиваться в случае внутриутробного заражения плода инфицированными лимфоцитами матери в период до проявления иммунной компетенции, то есть в первые 3 месяца развития эмбриона; у отдельных животных, например, у глубоко стельных коров, когда иммуноглобулины накапливаются в секрете молочной железы и т. д. (В. А. Крикун, 2002). Кроме того, описаны случаи серонегативности при наличии сопутствующих инфекций, например, вирусной диареи (В. А. Белявская и др., 2003).
Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции (Л. А. Иванова, 1999; K.T. Carli, A. Sen, H. Batmaz, E. Kennerman 1999). Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче (Н.Т. Джапаралиев, Л.Б. Прохватилова, А.И. Ломакин, П.К.Аянот, 2000, K.T. Carli, et al.1993, K.T.Carli, Sen А., Н. Batmaz,
Е.Kennerman, 1999). В литературе описаны случаи успешного оздоровления стад с использованием этого метода. Так, с применением набора на базе anti-gp51 моноклональных антител, за 4 года удалось полностью искоренить лейкоз на 3 фермах в Польше (W. Deren, A. Szewczyk-Sadowska, J. Rulka, 2003). В работе G. H. Suh, J.C. Lee, C.Y. Lee (2005) сообщается об успешном оздоровлении с использованием ИФА за три года стада с 30% уровнем инфицированности. Контрольные исследования показали отсутствие рецидивов в течение последующих трех лет.
В связи с изложенным выше, с целью ускорения полного оздоровления популяции КРС от лейкоза, целесообразно на последней стадии оздоровления исследовать все поголовье методами, выявляющими непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. С этой целью можно использовать прямой иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий детектировать непосредственно антигенные детерминанты.
Перспективной на конечном этапе оздоровления является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Мальцева Н.А. и др., 2004). Анализ литературных данных позволяет расположить методы диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующий ряд: РИД < Прямой ИФА < ПЦР.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК.
Некоторые области применения ПЦР – высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, анализ происхождения групп скота, прямое сиквенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных и бактериальных патогенов (А. А. Приймак, 1995, В. И. Глазко и др., 2000, Р. А. Волкова и др., 2000, Коновалова Е.Н., Сельцов В.И., Зиновьева Н.А., 2006).
Механизм ПЦР, с некоторой долей приближения, воспроизводит процессы на самом деле, происходящие в клетке при репликации ДНК.
Известно, что в присутствии нуклеозидтрифосфатов, ионов магния и одноцепочечной ДНК фермент ДНК – полимераза может синтезировать цепь ДНК, комплементарную исходной.
Так же известно, что для присоединения и начала работы ДНК – полимеразы необходимо наличие спаренного 3’- конца. В клетке ферментом РНК – праймазой синтезируется РНК – затравка (праймер), состоящий примерно из 10 нуклеотидов. Эти РНК – затравки и наращивает ДНК – полимераза (Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис, 1987, Э. Рис, М. Стенберг, 2002).
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных ДНК - праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК – полимеразой (рис.2).
Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК.
В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции – фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5 – концами праймеров на исследуемом участке ДНК.
В последние годы разработаны различные варианты ПЦР – диагностикумов для выявления вируса лейкоза КРС у нас в стране и за рубежом (Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновье-
ва, А.А. Ермилов, 2005). Праймеры для амплификации выбираются в различных частях генома: 5΄LTR, gag, env, Х- области (рис. 3).
Рис. 2. Диаграмма ПЦР
Длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются по формуле арифметической прогрессии. В противоположность этому – короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые появляются только в конце третьего цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации
GP51
5΄LTR gag pro pol env pX BL 3΄LTR
