ствах края с 6 - месячного возраста и до года составляет 30%, с года до 3 лет – 50%, а с 3 лет и старше 60 – 90%. Сравнивая результаты диагностических исследований, полученных ветеринарными лабораториями Краснодарского края, со средними показателями по РФ, следует отметить, что процент инфицированных животных в несколько раз превышает средний уровень по стране.
При подобной степени инфицированности лейкозом даже выбраковка РИД – позитивных животных не представляется возможной, не говоря уже о применении более дорогих и точных методов исследований, следовательно, требуется поиск новых альтернативных подходов.
Необходимо отметить, что в некоторых районах края есть положительный опыт борьбы с лейкозом КРС (например, в Каневском районе), но он основан на формировании «чистых» ферм – санированных ферм со здоровым поголовьем, завезенным, как правило, из-за границы (А. В. Прохоров, 2004).
Проблему легко можно бы было решить путем вакцинации телят. Однако соответствующая практичная и эффективная вакцина до сих пор не создана. Ведутся работы направленные на создание живой рекомбинантной вакцины против ВЛКРС на основе генно – инженерных рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих протективные антигены ВЛКРС (А. Д. Альтштеин, 2000).
Так же возможен генно – инженерный вариант решения проблемы. Так кроликам был пересажен антисмысловой ген, комплементарный области LTR R – U5 генома вируса лейкоза крупного рогатого скота, который обеспечивал устойчивость к BLV – инфекции трансгенных кроликов и их потомства, но подобные работы пока еще очень далеки от практического животноводства
(М. Муровска, С. Козырева, В. Томсоне, 2001).
В связи с изложенным выше, представляется актуальным вопрос о возможности ведения селекции на устойчивость к заболеванию лейкозом.
4. Практический опыт использования методов ДНК диагностики для оздоровлеия хозяйств от лейкоза КРС
Изучая опыт работы по оздоровлению от лейкоза некототорых хозяйств Краснодарского края мы сделали ряд общих выводов, а проведѐнные исследования позволили определиться с общей схемой оздоровления стада от лейкоза.
Одно из главных условий – наличие средств и мотивация обслуживающего персонала на использование одноразового ветеринарно-зоотехнического инструмента, что позволяет предотвратить возможность инфицирования здоровых животных.
Второе обязательное требование – наличие возможности пространственно разделять здоровых и больных животных, производить выпойку телят термически обработанным обратом. Только при выполнении этих условий существует смысл применять и комбинировать различные методы диагностики лейкоза. В большинстве же хозяйств диагностика проводится ради диагностики, год от года возрастает количество инфицированных и больных животных. Приходилось встречаться просто с парадоксальными случаями, когда в хозяйстве аккуратно разделяли животных на группы РИД позитивных и РИД негативных, а когда животные достигали возраста двух лет, группы объѐдиняли?!
В лаборатории биотехнологии СКНИИЖ с использованием метода ПЦР исследовано более 3000 образцов крови на наличие провирусной ДНК ВЛКРС.
Анализируя полученные результаты, хотелось бы отметить следующее. Результаты РИД и ПЦР исследований оказываются идентичными в 50-60% случаев. Когда речь идѐт о методах диагностики такого не простого заболевания как лейкоз крупного рогатого скота важно понимать, что ни один из существующих методов не лишен недостатков. Лейкоз – хроническое заболевание с волнообразным течением, во время развития которого у одного и того же животного может подниматься и снижаться уровень антител,
количество лимфоцитов, исчезать и появляться вирусная РНК, количественно меняться уровень провирусной ДНК. Соответственно, в определѐнные периоды развития заболевания тот или иной метод, будь это РИД, ПЦР или гематология, будет давать ложные результаты. Сопутствующие заболевания, стельность могут так же оказывать влияние на результаты исследований.
Исходя из сказанного выше, в том случае если в стаде высок процент инфицированных животных, отсечь их необходимо на самых ранних стадиях жизни животных. Если же заниматься диагностикой у взрослых животных, необходимо комбинировать различные методы, подбирать оптимальный период взятия анализов, то есть работать индивидуально с каждым животным, а это в условиях современного производства достаточно сложно.
Учитывая то, что ПЦР обеспечивает выявление непосредственно провируса, то есть результат анализа не зависит ни от возраста, ни от состояния животного, этот метод можно использовать для разделения телят на инфицированных и здоровых в возрасте до 5 месяцев, то есть тогда, когда использовать РИД нет смысла.
Установлено, что процент инфицированных телят к возрасту 3-4 месяца (по данным ПЦР – исследований) практически соответствует проценту РИД - позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем возрасте. Это, позволило предположить, что заражение животных происходит в возрасте до трех месяцев.
С целью установления момента инфицирования и возможного способа инфицирования был проведѐн следующий эксперимент. В хозяйствах ЗАО «Племзавод им. Чапаева» и АПФ «Нива» выделили по одной группе глубокостельных коров по 27 голов в каждой. За редким исключением все они положительно реагировали в РИД. В момент отѐла брались пробы крови у матери и телѐнка и исследовались с использованием ПЦР. Процедуру повторяли каждые полтора месяца до достижения телятами возраста 6 месяцев (табл.2).
Таблица 2
Динамика выявления инфицированных провирусом ЛКРС телят в
зависимости от возраста
| Хозяйство | Инфицировано телят, % | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| При рождении | 1,5 мес. | 3 мес. | 4,5 мес. | 6 мес. | |
| ЗАО «Племзавод им. Чапаева» | 0 | 3,7 | 3,7 | 3,7 | 3,7 |
| АПФ «Нива» | 0 | 7,4 | 7,4 | 7,4 | 7,4 |
Последнее ПЦР исследование совмещали с плановым серологическим исследованием. Телята до двух месяцев содержались в индивидуальных домиках, при всех зооветеринарных манипуляциях применялся только одноразовый инструмент. По результатам первого исследования (при рождении) среди телят не было выявлено ни одного носителя провирусной ДНК. Вирусоносители в каждой из групп появилоись по результатам второго исследования (в 1,5 мес.). Нами были проанализированы пробы молозива, полученного от явных носителей ВЛКРС (что было подтверждено результатами РИД и ПЦР анализов). Несмотря на присутствие в крови коров (n=10) провирусной ДНК, в пробах молозива (n=10) еѐ обнаружено не было. Однако это не является основанием считать молозиво безопасным в плане передачи вируса от инфицированных животных к здоровым. Вполне вероятно, что в молозиве вирус содержится в РНК – форме или в количестве не доступном для эффективного обнаружения провируса методом ПЦР.
Наиболее вероятным считаем путь инфицирования при прохождении родовых путей. Инфицированные телята были оставлены в группе. ПЦР анализы, проведѐнные в 3 и 4,5 месяца жизни животных подтвердили полученный ранее результат. Новых инфицированных животных выявлено не было. РИД-исследования в 6 месяцев дали
положительный результат именно у ПЦР-положительных телят.
Таким образом, метод ПЦР позволил выявить инфицированных животных в возрасте 1,5 месяцев. Это даѐт возможность сделать важный вывод: животных можно разделять на здоровых и вирусоносителей с использованием ПЦР до 2-х месячного возраста. При содержании телят в индивидуальных домиках, анализ необходимо провести до объединения их в группы, это значительно снизит риск распространения инфекции.
Проводимые мероприятия можно представить в следующей последовательности (табл.3):
Важной областью применения ПЦР является исследование импортированного скота, с целью предотвращения завоза ВЛКРС.
Так, среди импортных животных (ОАО «Племзавод «Кубань», n=354, завезены из Венгрии) методом РИД не были выявлены положительно реагирующие, а с помощью ПЦР удалось обнаружить одного носителя провирусной ДНК ЛКРС. Более того, провирусную ДНК выявили и в пробе крови теленка, полученного от ПЦР - позитивного животного. Носители провируса были удалены из стада.
Эффективно применение метода ПЦР на последних этапах оздоровления. Использование ПЦР совместно с другими методами снижает риск пропуска скрытого вирусоносителя, а, следовательно, избавляет от необходимости возвращаться к проблеме через некоторое время.
Таблица 3
Схема реализации оздоровительных мероприятий с использованием ПЦР – диагностики у телят
| Этап | Срок и порядок реализации |
|---|---|
| Формирование группы телочек (возраст 1,5-2 мес.) | При достижении животными 1,5 мес. взятие крови специалистами хозяйства и доставка в лабо- раторию в шприцах типа «Моновет» с ЭДТА или цитратом в качестве консерванта. |
| ПЦР – диагностика (диагностика методом полимеразной цепной реакции) | Реализуется в специализированной лаборатории |
| Формирование группы ПЦР- от- рицательных животных. Удаление ПЦР - положительных телочек на откорм или на другую ферму | Производится специалистами хозяйства по резуль- татам анализов |
| РИД-диагностика в группе ПЦР- отрицательных телочек с целью окончательного разделения групп инфицированных и здоровых жи- вотных (возраст 5-6 месяцев). | Реализуется специалистами хозяйства |
На примере одного из хозяйств края (ОАО «ПЗ «Дружба») продемонстрируем возможность использования ДНК диагностики для эффективного оздоровления стада от лейкоза КРС. Проведѐнные мероприятия включали два этапа:
-
Путѐм соответствующего подбора быков - производителей создание структуры стада с генетически обусловленной устойчивостью к развитию лейкоза
-
ПЦР – диагностика вирусоносительства у телят раннего возраста. На первом этапе, для подбора быков – производителей, нами были генотипированы по локусу BoLA DRB3 образцы крови от репрезентативной группы коров и тѐлок айрширской породы ОАО Племзавод «Дружба» (n=50). Основной принцип отбора этих животных заключался в том, чтобы в группу были включены пропорционально дочери разных быков. При этом анализировалась таблица № 14 «СЕЛЭКС», и если в стаде присутствова-
