Е.Kennerman, 1999). В литературе описаны случаи успешного оздоровления стад с использованием этого метода. Так, с применением набора на базе anti-gp51 моноклональных антител, за 4 года удалось полностью искоренить лейкоз на 3 фермах в Польше (W. Deren, A. Szewczyk-Sadowska, J. Rulka, 2003). В работе G. H. Suh, J.C. Lee, C.Y. Lee (2005) сообщается об успешном оздоровлении с использованием ИФА за три года стада с 30% уровнем инфицированности. Контрольные исследования показали отсутствие рецидивов в течение последующих трех лет.
В связи с изложенным выше, с целью ускорения полного оздоровления популяции КРС от лейкоза, целесообразно на последней стадии оздоровления исследовать все поголовье методами, выявляющими непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. С этой целью можно использовать прямой иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий детектировать непосредственно антигенные детерминанты.
Перспективной на конечном этапе оздоровления является полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Мальцева Н.А. и др., 2004). Анализ литературных данных позволяет расположить методы диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующий ряд: РИД < Прямой ИФА < ПЦР.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК.
Некоторые области применения ПЦР – высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, анализ происхождения групп скота, прямое сиквенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных и бактериальных патогенов (А. А. Приймак, 1995, В. И. Глазко и др., 2000, Р. А. Волкова и др., 2000, Коновалова Е.Н., Сельцов В.И., Зиновьева Н.А., 2006).
Механизм ПЦР, с некоторой долей приближения, воспроизводит процессы на самом деле, происходящие в клетке при репликации ДНК.
Известно, что в присутствии нуклеозидтрифосфатов, ионов магния и одноцепочечной ДНК фермент ДНК – полимераза может синтезировать цепь ДНК, комплементарную исходной.
Так же известно, что для присоединения и начала работы ДНК – полимеразы необходимо наличие спаренного 3’- конца. В клетке ферментом РНК – праймазой синтезируется РНК – затравка (праймер), состоящий примерно из 10 нуклеотидов. Эти РНК – затравки и наращивает ДНК – полимераза (Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис, 1987, Э. Рис, М. Стенберг, 2002).
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных ДНК - праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК – полимеразой (рис.2).
Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК.
В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции – фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5 – концами праймеров на исследуемом участке ДНК.
В последние годы разработаны различные варианты ПЦР – диагностикумов для выявления вируса лейкоза КРС у нас в стране и за рубежом (Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновье-
ва, А.А. Ермилов, 2005). Праймеры для амплификации выбираются в различных частях генома: 5΄LTR, gag, env, Х- области (рис. 3).
Рис. 2. Диаграмма ПЦР
Длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются по формуле арифметической прогрессии. В противоположность этому – короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые появляются только в конце третьего цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации
GP51
5΄LTR gag pro pol env pX BL 3΄LTR
LTR – длинные концевые повторы (long terminal repeat);
gag – ген, кодирующий белки сердцевины (определяет группоспецифический анти-
ген);
pro – ген, кодирующий протеазу; pol – ген, кодирующий обратную транскриптазу; env – ген, кодирующий белки оболочки; pX BL – область, кодирующая Tax и Rex
Помимо выявления провируса и вируса в крови животных, ПЦР – технологии позволяют проводить генотипирование вируса ЛКРС. Установлено, что существуют особые варианты вируса, при инфицировании которыми животные остаются серонегативными в течение всего периода инфицирования, и даже в случае прогрессии заболевания. Об успешном применении метода ПЦР в диагностике лейкоза сообщается в работах Н. В. Кузнецова и др. (1997), А. И. Ломакина и др. (1999).
Важной областью применения ПЦР является исследование импортированного скота, находящегося в карантине, с целью предотвращения завоза ВЛКРС из одной страны в другую. Существенно ограничивает применение метода ПЦР его высокая стоимость и трудоемкость, поэтому его целесообразно использовать только для исследования высокоценных животных. Кроме указанных выше случаев ПЦР можно рекомендовать для контроля вакцин из цельной крови на специфическую стерильность (М. И. Гулюкин и др., 2002).
Ряд авторов D. Beier, P. Blankenstein,, H. Fechner, 1992, P. Blankenstein, H. Fechner, A. Looman, A. Beier, A. Marguardt, D. Ebner, 1998, сообщает, что довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР – позитивные особи выявляются среди РИД – отрицательных животных, а ПЦР – негативные, среди РИД – позитивных. Вполне вероятно, что, несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативной. Поэтому имеет смысл «дочищать» ПЦР РИД - и ИФА – негативных животных, при таком комбинированном использовании диагностических методов гарантировано эффективное оздоровление стада. Обнадеживающие результаты получены В.В. Макаровым, Д.П. Гринишиным (2005), которым удалось доказать, что использование комбинированной РИД/ПЦР диагностики более чем в два раза ускоряет процесс оздоровления стада от лейкоза, чем использование только исследований в РИД. Авторы отмечают, что при жесткой браковке животных, положительно реагирующих в РИД, «шлейф» РИД - позитивных особей продолжал выявляться до 9 – го исследования, а при совместном РИД/ПЦР - исследовании - до 4 – го.
Другие методы ДНК – анализа так же показывают большую чувствительность по сравнению с РИД. Так, N. A Maltseva., A. S. Kaledin, E. I. Oliynik A. A. Zhivotov, V. I. Baranov (2002) показали, что метод Дот- гибридизации (ДНК, выделенная из крови животного метится и гибридизуется с зондом, комплементарным последовательности провируса) позволил выявить большее количество инфицированных животных.
По данным А. Г. Шипицина и др. (1999) в Краснодарском крае первые случаи лейкоза отмечались в 1955 году. В 2006 году было исследовано серологически 467597 голов, выявлено 209904 (42%) инфицированных животных, 18360 (4%) животных признаны гематологически больными. Ежегодно ветеринарными лабораториями края проводится около 450 000 серологических и 180 000 гематологических исследований (А.Г. Шипицын, А.В. Скориков, Т.Н. Чопик и др., 2006). При этом инфицированность молодняка в хозяй-
