ва, А.А. Ермилов, 2005). Праймеры для амплификации выбираются в различных частях генома: 5΄LTR, gag, env, Х- области (рис. 3).
Рис. 2. Диаграмма ПЦР
Длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются по формуле арифметической прогрессии. В противоположность этому – короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые появляются только в конце третьего цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации
GP51
5΄LTR gag pro pol env pX BL 3΄LTR
LTR – длинные концевые повторы (long terminal repeat);
gag – ген, кодирующий белки сердцевины (определяет группоспецифический анти-
ген);
pro – ген, кодирующий протеазу; pol – ген, кодирующий обратную транскриптазу; env – ген, кодирующий белки оболочки; pX BL – область, кодирующая Tax и Rex
Помимо выявления провируса и вируса в крови животных, ПЦР – технологии позволяют проводить генотипирование вируса ЛКРС. Установлено, что существуют особые варианты вируса, при инфицировании которыми животные остаются серонегативными в течение всего периода инфицирования, и даже в случае прогрессии заболевания. Об успешном применении метода ПЦР в диагностике лейкоза сообщается в работах Н. В. Кузнецова и др. (1997), А. И. Ломакина и др. (1999).
Важной областью применения ПЦР является исследование импортированного скота, находящегося в карантине, с целью предотвращения завоза ВЛКРС из одной страны в другую. Существенно ограничивает применение метода ПЦР его высокая стоимость и трудоемкость, поэтому его целесообразно использовать только для исследования высокоценных животных. Кроме указанных выше случаев ПЦР можно рекомендовать для контроля вакцин из цельной крови на специфическую стерильность (М. И. Гулюкин и др., 2002).
Ряд авторов D. Beier, P. Blankenstein,, H. Fechner, 1992, P. Blankenstein, H. Fechner, A. Looman, A. Beier, A. Marguardt, D. Ebner, 1998, сообщает, что довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР – позитивные особи выявляются среди РИД – отрицательных животных, а ПЦР – негативные, среди РИД – позитивных. Вполне вероятно, что, несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативной. Поэтому имеет смысл «дочищать» ПЦР РИД - и ИФА – негативных животных, при таком комбинированном использовании диагностических методов гарантировано эффективное оздоровление стада. Обнадеживающие результаты получены В.В. Макаровым, Д.П. Гринишиным (2005), которым удалось доказать, что использование комбинированной РИД/ПЦР диагностики более чем в два раза ускоряет процесс оздоровления стада от лейкоза, чем использование только исследований в РИД. Авторы отмечают, что при жесткой браковке животных, положительно реагирующих в РИД, «шлейф» РИД - позитивных особей продолжал выявляться до 9 – го исследования, а при совместном РИД/ПЦР - исследовании - до 4 – го.
Другие методы ДНК – анализа так же показывают большую чувствительность по сравнению с РИД. Так, N. A Maltseva., A. S. Kaledin, E. I. Oliynik A. A. Zhivotov, V. I. Baranov (2002) показали, что метод Дот- гибридизации (ДНК, выделенная из крови животного метится и гибридизуется с зондом, комплементарным последовательности провируса) позволил выявить большее количество инфицированных животных.
По данным А. Г. Шипицина и др. (1999) в Краснодарском крае первые случаи лейкоза отмечались в 1955 году. В 2006 году было исследовано серологически 467597 голов, выявлено 209904 (42%) инфицированных животных, 18360 (4%) животных признаны гематологически больными. Ежегодно ветеринарными лабораториями края проводится около 450 000 серологических и 180 000 гематологических исследований (А.Г. Шипицын, А.В. Скориков, Т.Н. Чопик и др., 2006). При этом инфицированность молодняка в хозяй-
ствах края с 6 - месячного возраста и до года составляет 30%, с года до 3 лет – 50%, а с 3 лет и старше 60 – 90%. Сравнивая результаты диагностических исследований, полученных ветеринарными лабораториями Краснодарского края, со средними показателями по РФ, следует отметить, что процент инфицированных животных в несколько раз превышает средний уровень по стране.
При подобной степени инфицированности лейкозом даже выбраковка РИД – позитивных животных не представляется возможной, не говоря уже о применении более дорогих и точных методов исследований, следовательно, требуется поиск новых альтернативных подходов.
Необходимо отметить, что в некоторых районах края есть положительный опыт борьбы с лейкозом КРС (например, в Каневском районе), но он основан на формировании «чистых» ферм – санированных ферм со здоровым поголовьем, завезенным, как правило, из-за границы (А. В. Прохоров, 2004).
Проблему легко можно бы было решить путем вакцинации телят. Однако соответствующая практичная и эффективная вакцина до сих пор не создана. Ведутся работы направленные на создание живой рекомбинантной вакцины против ВЛКРС на основе генно – инженерных рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих протективные антигены ВЛКРС (А. Д. Альтштеин, 2000).
Так же возможен генно – инженерный вариант решения проблемы. Так кроликам был пересажен антисмысловой ген, комплементарный области LTR R – U5 генома вируса лейкоза крупного рогатого скота, который обеспечивал устойчивость к BLV – инфекции трансгенных кроликов и их потомства, но подобные работы пока еще очень далеки от практического животноводства
(М. Муровска, С. Козырева, В. Томсоне, 2001).
В связи с изложенным выше, представляется актуальным вопрос о возможности ведения селекции на устойчивость к заболеванию лейкозом.
4. Практический опыт использования методов ДНК диагностики для оздоровлеия хозяйств от лейкоза КРС
Изучая опыт работы по оздоровлению от лейкоза некототорых хозяйств Краснодарского края мы сделали ряд общих выводов, а проведѐнные исследования позволили определиться с общей схемой оздоровления стада от лейкоза.
Одно из главных условий – наличие средств и мотивация обслуживающего персонала на использование одноразового ветеринарно-зоотехнического инструмента, что позволяет предотвратить возможность инфицирования здоровых животных.
Второе обязательное требование – наличие возможности пространственно разделять здоровых и больных животных, производить выпойку телят термически обработанным обратом. Только при выполнении этих условий существует смысл применять и комбинировать различные методы диагностики лейкоза. В большинстве же хозяйств диагностика проводится ради диагностики, год от года возрастает количество инфицированных и больных животных. Приходилось встречаться просто с парадоксальными случаями, когда в хозяйстве аккуратно разделяли животных на группы РИД позитивных и РИД негативных, а когда животные достигали возраста двух лет, группы объѐдиняли?!
В лаборатории биотехнологии СКНИИЖ с использованием метода ПЦР исследовано более 3000 образцов крови на наличие провирусной ДНК ВЛКРС.
Анализируя полученные результаты, хотелось бы отметить следующее. Результаты РИД и ПЦР исследований оказываются идентичными в 50-60% случаев. Когда речь идѐт о методах диагностики такого не простого заболевания как лейкоз крупного рогатого скота важно понимать, что ни один из существующих методов не лишен недостатков. Лейкоз – хроническое заболевание с волнообразным течением, во время развития которого у одного и того же животного может подниматься и снижаться уровень антител,
