положительный результат именно у ПЦР-положительных телят.
Таким образом, метод ПЦР позволил выявить инфицированных животных в возрасте 1,5 месяцев. Это даѐт возможность сделать важный вывод: животных можно разделять на здоровых и вирусоносителей с использованием ПЦР до 2-х месячного возраста. При содержании телят в индивидуальных домиках, анализ необходимо провести до объединения их в группы, это значительно снизит риск распространения инфекции.
Проводимые мероприятия можно представить в следующей последовательности (табл.3):
Важной областью применения ПЦР является исследование импортированного скота, с целью предотвращения завоза ВЛКРС.
Так, среди импортных животных (ОАО «Племзавод «Кубань», n=354, завезены из Венгрии) методом РИД не были выявлены положительно реагирующие, а с помощью ПЦР удалось обнаружить одного носителя провирусной ДНК ЛКРС. Более того, провирусную ДНК выявили и в пробе крови теленка, полученного от ПЦР - позитивного животного. Носители провируса были удалены из стада.
Эффективно применение метода ПЦР на последних этапах оздоровления. Использование ПЦР совместно с другими методами снижает риск пропуска скрытого вирусоносителя, а, следовательно, избавляет от необходимости возвращаться к проблеме через некоторое время.
Таблица 3
Схема реализации оздоровительных мероприятий с использованием ПЦР – диагностики у телят
| Этап | Срок и порядок реализации |
|---|---|
| Формирование группы телочек (возраст 1,5-2 мес.) | При достижении животными 1,5 мес. взятие крови специалистами хозяйства и доставка в лабо- раторию в шприцах типа «Моновет» с ЭДТА или цитратом в качестве консерванта. |
| ПЦР – диагностика (диагностика методом полимеразной цепной реакции) | Реализуется в специализированной лаборатории |
| Формирование группы ПЦР- от- рицательных животных. Удаление ПЦР - положительных телочек на откорм или на другую ферму | Производится специалистами хозяйства по резуль- татам анализов |
| РИД-диагностика в группе ПЦР- отрицательных телочек с целью окончательного разделения групп инфицированных и здоровых жи- вотных (возраст 5-6 месяцев). | Реализуется специалистами хозяйства |
На примере одного из хозяйств края (ОАО «ПЗ «Дружба») продемонстрируем возможность использования ДНК диагностики для эффективного оздоровления стада от лейкоза КРС. Проведѐнные мероприятия включали два этапа:
-
Путѐм соответствующего подбора быков - производителей создание структуры стада с генетически обусловленной устойчивостью к развитию лейкоза
-
ПЦР – диагностика вирусоносительства у телят раннего возраста. На первом этапе, для подбора быков – производителей, нами были генотипированы по локусу BoLA DRB3 образцы крови от репрезентативной группы коров и тѐлок айрширской породы ОАО Племзавод «Дружба» (n=50). Основной принцип отбора этих животных заключался в том, чтобы в группу были включены пропорционально дочери разных быков. При этом анализировалась таблица № 14 «СЕЛЭКС», и если в стаде присутствова-
ло, например, 200 дочерей быка № 1, 400 дочерей – быка № 2 и 100 - № 3, то в группу для анализа (n=50) были отобраны – 14 дочерей быка № 1, 29 - № 2 и 7 - № 3. Необходимо отметить, что для анализа отбирались молодые животные: тѐлки предслучного и случного возраста (10-18 месяцев), нетели (3-6 месячной стельности), первотѐлки (животные с первой незаконченной лактацией).
В результате генотипирования было установлено, что:
1) в настоящее время генетический профиль животных ОАО Племзавод «Дружба» насыщен аллелями BoLA-DRB 37; BoLA-DRB 324; BoLA-DRB 3*27 (табл. 4);
2) низкая частота встречаемости устойчивых аллелей (в сумме BoLA-DRB3 *11, 23, 28 аллелей всего 7%) свидетельствует о генетической предрасположенности основной массы животных к лейкозу.
Следует отметить, что анализ частот встречаемости аллелей у всех использованных ранее в хозяйстве (за последние 8 лет) быков-производителей (n=24), дочери которых к моменту исследования присутствовали в стаде, показал сходные результаты (табл. 4).
Таблица 4
Результаты анализа генетического профиля стада ОАО Племзавод «Дружба»
| Аллель BoLA- DRB 3 | Статус аллеля+ | Частота встречаемости аллеля*, % | ||
|---|---|---|---|---|
| В генотипированной выборке (n=50) | В группе быков – отцов (n=24) | У потомков в результате закрепления (прогноз) | ||
| 1 | Н | 5 | 1 | 5 |
| 2 | Н | 7 | - | 3 |
| 3 | Н | 7 | 6 | 4 |
| 5 | Н | 3 | 8 | 2 |
| 7 | Н | 19 | 14 | 9 |
| 8 | Ч | 2 | 2 | 15 |
| 9 | Н | - | 2 | - |
| 11 | У | - | 3 | 15 |
| 12 | Н | 4 | 5 | 5 |
| 16 | Ч | 6 | 11 | 3 |
| 18 | Н | 6 | 3 | 10 |
| 21 | Н | 4 | 1 | 2 |
| 22 | Ч | 2 | 2 | 8 |
| 24 | Ч | 15 | 18 | 8 |
| 27 | Н | 13 | 15 | 7 |
| 28 | У | 7 | 9 | 4 |
Примечание: *значения частот округлены до целых; + У – устойчивый: Ч- чувствительный: Н – нейтральный
Очевидны аналогичные тенденции преобладания определѐнных разновидностей аллелей: BoLA-DRB 37; BoLA-DRB 324; BoLA-DRB 3*27 (профиль рассчитывался с поправкой на количество дочерей каждого из быков).
Для повышения гетерогенности животных (а, следовательно, привнесения генетических задатков гетерозиса) мы использовали быков-производителей, носителей редко встречающихся в данном стаде аллелей. Учитывая результаты анализа крови и генеалогической структуры стада, для осеменения коров мы рекомендовали следующих быковпроизводителей (табл. 5,6).
Таблица 5
Характеристики предлагаемых к использованию быков-производителей
| Кличка, № | Место рождения | Линия | Генотип | BoLA-DRB3 |
|---|---|---|---|---|
| Гейзер 441 | Финляндия | С.В. Командор 174233 | 11 (У) | 8 (Ч) |
| Круиз 45586 | Финляндия | Дик 768 | 18 (Н) | 22 (Ч) |
| Тупси 76849 | Финляндия | Дик 768 | 1 (Н) | 12 (Н) |
Таблица 6
Молочная продуктивность матерей быков-производителей, предлагаемых к использованию
| Кличка, № | Продуктивность матери | ||
|---|---|---|---|
| удой по наивысшей лактации, кг | содержание жира, % | содержание белка, % | |
| Гейзер 441 | 14308 | 4,73 | 3,10 |
| Круиз45586 | 10875 | 4,12 | 3,52 |
| Тупси76849 | 10991 | 4,28 | 3,50 |
Быки были отобраны из базы данных по быкам-производителям ведущих племенных предприятий России, сформированной в лаборатории. Всего база содержит полную информацию (племенную и генетическую) по 800 быкам-производителям, принадлежащим 7 племенным предприятиям. Перечень айрширских быков, из которых был произведѐн отбор по всем традиционным критериям, был представлен 110 животными, генотипированными по BoLA-DRB 3.
Закрепление быков было произведено «тройкой», со сменой быка после каждого перегула. Например, если после осеменения быком-производителем Гейзер 441 корова пришла в охоту (по нашим данным, на долю первого быка в «тройке» приходится около 60% плодотворных осеменений), проводили осеменение быком-производителем Круиз 45586 (30-20% осеменений), а в случае следующего перегула – Тупси 76849 (около 10-20 % осеменений). Исходя из этих данных определялась частота встречаемости аллелей в отцовской группе.
В результате такого закрепления увеличилось количество животных с гетерозиготными генотипами, аллельный профиль стада стал более выровненным, возрасло количество животных - носителей аллелей устойчивости (до 19%) (табл. 4, 7).
Таблица 7
Количество гомо- и гетерозиготных животных до- и после закрепления
| Количество гомо- и гетерозигот | До закрепления (по | После закрепления |
|---|---|---|
| результатам анализа ДНК) | у потомства (прогноз) | |
| Гомозиготы, % | 14 | 2 |
| Гетерозиготы, % | 86 | 98 |
При сопоставлении наблюдаемых частот с ожидаемыми после закрепления у потомства выявлена существенная разница (P<0.05).
Подбор новых быков – производителей, несущих редкие для данного стада генетические блоки (аллели), способствовал значительному (на 19%) снижению расхода спермы на одно плодотворное осеменение по данным зоотехнического учѐта (n=700). По нашему мнению, это, вероятно, объясняется устранением генетической несовместимости отцов и матерей. Необходимо отметить, что в опытный (1-4.2011) и контрольный периоды времени (1-4.2012) в хозяйстве использовались молодые быки финской селекции, принадлежа-
