При комиссионном исследовании в Арской ветеринарной лаборатории 200 проб фекалий методом последовательного промывания снова были получены отрицательные результаты у всех животных. В РСК с фасциоловым антигеном в разведении сыворотки 1:5 реагировали 9 проб сывороток в разведении 1:10 – 14 и в разведении 1:20 – 15 проб. Всего положительно реагировали 38 животных, что составляет 19 % к числу исследованных.
У 17 коров, положительно реагировавших в РСК с фасциоловым антигеном, были взяты пробы фекалий для копрологического исследования.
При исследовании методом последовательного промывания яйца фасциол не обнаружены. В конце опыта из 17 коров, реагирующих в РСК на фасциолез, 3 – были подвергнуты убою. При неполном гельминтологическом вскрытии в желчных протоках печени обнаружены фасциолы. Количество фасциол в печени у одной коровы составило 46, у второй – 26 и третьей – 37.
Данные исследований 6 хозяйств Арского и Высокогорского районов, проведенные в ветеринарных лабораториях показали, что при применении метода последовательного промывания в 4 хозяйствах (КП «Игенче», учхоз КГАВМ, агрофирма «Нокса» Высокогорского и КП «Пошалым» Арского районов) яйца фасциол также не выявляются. Однако при неполном гельминтологическом вскрытии печени на Казанском мясокомбинате у некоторых животных были обнаружены фасциолы.
В дальнейшем было проведено исследование фекалий крупного рогатого скота из этих же хозяйств модифицированным нами методом. Исследовано 1200 голов крупного рогатого скота из 9 хозяйств Арского, и Высокогорского Кукморского районов. Модифицированным гельминтоовоскопическим методом выявлено 156 инвазированных фасциолезом животных (13 %), в то время как методом последовательного смыва обнаружено 23 (1,9 %) инвазированных животных. В РСК выявлено 194 инвазированных животных, что составляет 16,1%.
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что комбинированный метод экстрагирования позволяет получить активный и специфичный фасциоловый антиген для постановки реакции связывания комплемента.
В неблагополучном по фасциолезу хозяйстве РСК с фасциоловым антигеном намного превосходит по выявлению инвазированных животных гельминтоовоскопические методы. При этом отмечено очень низкая разрешающая способность метода последовательного промывания, который в основном принят в ветеринарных лабораториях Республики Татарстан. Для реальной оценки гельминтологической ситуации нужно проводить комплексные исследования, в том числе серологические и копрологические по усовершенствованной методике.
Следующим этапом наших исследований являлось совершенствование серологической диагностики фасциолеза путем изготовления активного и специфического антигена для реакции иммуноферментного анализа.
Материалом для получения антигена служили фасциолы из желчных ходов печени крупного рогатого скота, полученные при убое животных на мясокомбинате. Живых гельминтов многократно промывали физиологическим раствором до полного удаления желчи и кровяных сгустков и до отсутствия опалесценции в промывочной жидкости.
При убое путем неполного гельминтологического вскрытия и исследования крови определяли здоровых животных, а также инвазированных фасциолезом, дикроцелиозом и эхинококкозом. Сыворотки крови от здоровых животных служили как позитивные, а от больных дикроцелиозом и эхинококкозом для контроля специфичности полученных фасциоловых диагностикумов.
Антигены из фасциол готовили разными методами. Первая технологическая модификация заключалась в следующем. После последнего промывания фасциол физиологическим раствором их помещали в ацетон –
90
эфир в равном соотношении и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. После смесь ацетон – эфир выливали, а фасциол высушивали. Затем их взвешивали и размельчали в ступке. Полученный порошок разводили в и бикарбонатно-карбонатном буферном растворе (БКБ) подвергали ультразвуковому воздействию.
Во втором варианте после 5-ти кратного промывания фасциол в физиологическом растворе, их высушивали в термостате при 37о С и затем растирали в ступке. Из полученного порошка готовили суспензию на физиологическом растворе в присутствии 1% тритона Х-100 и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 3 минут. Готовую суспензию переосаждали насыщенным раствором сульфата аммония и центрифугировали. В качестве антигена использовали осадок.
Третий антиген был приготовлен комбинированным методом. После последнего промывания фасциол, их помещали в ацетон – эфир в соотношении 1:1 и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Затем гельминтов высушивали в термостате при 37о С в течение 2-х часов, взвешивали и размельчали в ступке. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид (ДМСО), подогретый до 37о С, доводили концентрацию суспензии до 1% взвеси и помещали в холодильник на 24 часа. Затем суспензию центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость переливали в пробирки из толстого стекла и подвергали 5-ти кратному замораживанию и оттаиванию. Образующийся флоккулят осаждали центрифугированием. Фасциоловый экстракт диализировали против дистиллированной воды в течение суток со сменой раствора 4-5 раз и использовали в качестве антигена для ИФА.
Количество белка в антигенах определяли с помощью спектрофотометра СФ-4А при длине волны 280 нм.
Для очистки фасциолового антигена использовали метод ультрацентрифугирования с помощью ультрацентрифуги L7 Вескман.
