выявить в среднем 44,2 % яиц фасциол в 1 мл поверхности взвеси. Эти же ингредиенты при соотношении 1:1 дали возможность обнаружить в среднем 39,6 % яиц фасциол.
Наиболее эффективной оказалась флотационная жидкость, состоящая из трех ингредиентов – насыщенных солей хлорида цинка, хлорида натрия и сахара в соотношении 2:1:1. С помощью этой флотационной жидкости (удельный вес 1,63) по методу Котельникова-Вареничева было выявлено в среднем 60,2 % яиц фасциол.
При уменьшении удельного веса флотационной жидкости из трех ингредиентов снижалась и диагностическая эффективность этого метода. Так, при соотношении базисных растворов 2:1:2 (при удельном весе 1,60) было обнаружено в среднем 52,6 % фасциол, а соотношение ингредиентов 2:2:1 (при удельном весе 1,58) дало возможность выявить в среднем 40,8 % яиц гельминтов.
Наименьшее число яиц фасциол (28,6 %) выявлено с помощью флотационного раствора в соотношении ингредиентов 1:1:1, удельный вес которого составлял 1,55.
Таким образом, результаты проведенных исследований по изучению сравнительной эффективности гельминтоовоскопических методов при фасциолезе крупного рогатого скота показали, что наиболее высокой диагностической эффективностью обладает усовершенствованный копрологический метод Котельникова–Вареничева с использованием флотационной жидкости, состоящей из трех ингредиентов: насыщенных солей хлорида цинка, хлорида натрия и сахара в соотношении 2:1:1.
Глава 7. Совершенствование серологической диагностики фасциолеза
По мнению многих авторов, наиболее перспективными для прижизненной диагностики фасциолеза являются иммунологические методы,
так как существующие копрологические методы выявляют фасциол в организме животных лишь в половозрелой стадии.
Поэтому разработка новых методов диагностики этого заболевания особенно в ранних стадиях развития возбудителя, остается актуальной проблемой.
Для решения этого вопроса вначале была поставлена задача – изыскать метод получения антигена для реакции связывания комплемента (РСК) и получить активный и специфичный диагностикум.
При убое животных на Казанском мясокомбинате брали кровь, а также исследовали печень на наличие гельминтов методом неполного гельминтологического вскрытия. Фасциолы, собранные из желчных протоков печени крупного рогатого скота, служили материалом для получения фасциоловых антигенов. Их собрали в термос с физиологическим раствором, нагретым до 37о С. Живых гельминтов многократно промывали физиологическим раствором до полного удаления желчи и кровяных сгустков и до отсутствия опалесценции в промывочной жидкости.
Методом неполного гельминтологического вскрытия выявляли животных здоровых и инвазированных фасциолезом, дикроцелиозом и эхинококкозом и брали у них кровь. Из полученных проб крови отделяли сыворотки, которые консервировали сухой борной кислотой и хранили в холодильнике при – 5о С.
Антигены готовили разными методами. В этих целях, после последнего промывания фасциол физиологическим раствором их высушивали в термостате при 37о С.
Затем фасциол взвешивали, растирали в порошок и из него готовили 10 % суспензию на физиологическом растворе. Полученную суспензию в первом варианте подвергали 5-ти кратному замораживанию и оттаиванию, во втором – соединяли с равным объемом эфира, в третьем – с равным объемом ацетона, в четвертом – экстрагировали на диметилсульфоксиде, в пятом – подвергали ультразвуковому воздействию. В шестом варианте использовали
комбинированный метод изготовления, включающий все эти воздействия (кроме ультразвукового экстрагирования). После экстракции полученные пробы антигенов центрифугировали, надосадочную жидкость использовали в качестве диагностикума для РСК.
Разработанный нами комбинированный метод изготовления антигена, заключался в следующем. После последнего промывания фасциол в физиологическом растворе их заливали ацетон – эфиром и выдерживали при комнатной температуре. Затем смесь ацетон – эфира выливали, фасциол высушивали и растирали в порошок. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид и смесь инкубировали при 37о С. Затем добавляли физиологический раствор, доводя концентрацию суспензии до 1 % взвеси фасциол и центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость подвергали замораживанию и оттаиванию, образующийся флоккулят центрифугировали, надосадочную жидкость подвергали диализу. Полученный фасциоловый антиген консервировали мертиолятом 1:10000 и определяли его рабочий титр в РСК.
В целях стандартизации полученного антигена при экстрагировании на 1 г высушенных фасциол добавляли 100 мл физиологического раствора, а затем в нем с помощью спектрофотометра определяли количество белка. Для определения рабочего титра антигенов их разводили в соотношениях 1:10, 1:20, 1:30 и 1:40. Предельным титром антигена считали разведение, которое давало полную задержку гемолиза с наибольшим разведением позитивной фасциоловой сыворотки.
Активность полученного антигена в РСК определяли титрованием его по квадратной схеме. Для этого использовали позитивную фасциоловую сыворотку в разведениях 1:5. 1:10, 1:20 и 1:40, а также негативную сыворотку в разведениях 1:5 и 1:10.
Для контроля специфичности полученного антигена ставили РСК с сыворотками крови здорового крупного рогатого скота, а также инвазированного дикроцелиозом и эхонококкозом.
