Второй день. Макроскопически изучают выросшие на чашке Петри колонии бактерий: определяют их величину, очертания, степень прозрачности, цвет, поверхность, наличие зоны В-гемолиза, затем выявляют под микроскопом структуру и края колоний. Наряду с характерными колониями предполагаемого возбудителя обнаруживают рост колоний разнообразной условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры: стрептококков, стафилококков, Е. coli и др. Затем тщательно отбирают характерные $5-формы (гладкие) колоний с 30ной В-гемолиза и делают высевы на твердые и жидкие питательные среды.
Третий день. На кровяном мясопептонном агаре возбудитель ИКК крупного рогатого скота образует гладкие, круглые, выпуклые в центре, блестящие, серовато-белого цвета колонии от | до 3 мм в диаметре с шириной зоны В-гемолиза 0,5-2,0 мм.
Из отдельных колоний готовят мазок и окрашивают по Граму. При микроскопии устанавливают морфологические особенности бактерий и отношение к окраске по Граму. В положительных случаях при обработке спиртом грамотрицательные бактерии обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в розово-красный цвет.
При просмотре мазков, приготовленных из суточных колоний, окрашенных по Граму и Романовскому-Гимзе, бактерии Moraxella bovis представляют собой короткие толстые палочки длиной 1,52,0 мкм и шириной 0,5-1,0 мкм с округлыми концами, расположенных парами или в виде коротких цепочек. Старые культуры и культуры после 48-72-часовой инкубации прогрессивно становятся полиморфными, проявляя вариабельность в размерах и форме клеток. Бактерии Moraxella bovoculi представляют собой грамотрицательные диплококки с редко встречающимися кокками; диаметр клеток составляет 0,7-1,3 мкм, смежные стороны их часто уплощены.
На МПБ через 24-48 часов инкубации при 37°С наблюдается помутнение бульона с образованием небольшого осадка.
Четвертый день. Выделенную культуру идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, ферментативным (биохимическим) свойствам, а также по иммунологическим реакциям с положительной сывороткой. Для этого чистую культуру
высевают в пробирки с соответствующими средами для определения сахаролитических (среды Pucca), протеолитических (MIDK, лакмусовое молоко), гемолитических (кровяной мясопептонный агар), восстанавливающих свойств (нитратная среда), а также на каталазную и оксидазную активность.
О протеолитических свойствах культур бактерий судят по их способности разжижать желатин. Для обнаружения протеолитических ферментов производят посев чистой культуры бактерий методом укола в столбик мясопептоного желатина. Посевы выдерживают при комнатной температуре (20-22°С) в течение трех суток. Разжижение бывает слоистое, в основном в верхней части пробирки, которое при длительной инкубации спускается ниже, образуя воронку.
Для установления способности микроорганизмов вырабатывать оксидазу на поверхность 18-часовой агаровой культуры бактерий наносят каплю 1%-ного раствора парааминодиметиланилина гидрохлорида и каплю 5%-ного спиртового раствора а-нафтола. При положительной реакции через 1-3 мин культура бактерий окрашивается в ярко-синий цвет. Положительная проба на оксидазу является характерным признаком для микроорганизмов семейства Moraxellaceae и роду Moraxella.
Для определения ферментации каталазы изучаемой культурой бактерий на поверхность 24-часовой культуры на скошенном МПА наливают 1-2 мл 1%-ного раствора перекиси водорода. Появление пузырьков газа при наклонном положении пробирки регистрируется как положительная реакция. Культуры бактерий рода Moraxella являются каталазаотрицательными.
При выявлении образований индола культурой бактерий предполагаемого возбудителя ИКК крупного рогатого скота используют способ Мореля. Узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (индикаторная бумага). При выделении индола на первый-третий день нижняя часть полоски бумаги вследствие соединения индола со щавелевой кислотой приобретает розовый цвет. Как правило, бактерии рода Moraxella не образуют индола.
В средах Гисса культуры бактерий Moraxella не оказывают ферментирующего действия на сахара. При посеве их в нитратную сре-
ду изменения также не наблюдаются, это означает, что они не редуцируют нитраты в нитриты.
Бактерии Moraxella патогенны для белых мышей: вызывают их гибель в течение 24 ч при внутрибрюшинном введении им суточной агаровой культуры в дозе 500 млн микробных клеток.
Основные критерии для идентификации выделенных культур бактерий — предполагаемых возбудителей ИКК крупного рогатого скота: они неподвижны, не образуют спор, окрашиваются грамотрицательно, факультативные аэробы, не ферментируют сахаров, не редуцируют нитраты в нитриты, не образуют индол, разжижают желатин, пептонизируют лакмусовое молоко, показывают положительную реакцию на оксидазу.
В ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработан «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа» (ИКК-серотест) [12], предназначенный для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis в сыворотке крови методом ИФА с целью диагностики инфекционного кератоконъюнктивита у невакцинированных животных и оценки напряженности поствакцинального иммунитета. Набор реагентов рассчитан на проведение на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых и двух контрольных сывороток (в двух повторах каждая).
Окончательный диагноз на ИКК устанавливают по результатам бактериологических исследований клинического и патологического материалов, полученных от телят в острой стадии болезни. Диагноз считают подтвержденным, если:
— выделена чистая культура бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi с зоной В-гемолиза;
— определена родовая и видовая принадлежность их на основе результатов испытания морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств;
— выявлено их антигенное родство относительно референтных штаммов бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi в иммунологических реакциях с позитивными сыворотками;
— подтверждена патогенность гемолитических форм бактерий Moraxella bovis и Moraxella bovoculi в отношении белых мышей.
