1.7.7. Внесение субстратной смеси
Субстратной смесью ‚для пероксидазы является ортофенилендиамин, растворенный в метиловом спирте. На 20 мл цитратного буферного раствора pH 4,7 берут 200 мкл смеси ортофенилендиамина -- ‘метанол и добавляют 2 мкл 30% Н.О.. Субстратную смесь B объеме 200 мкл вносят в каждую лунку планшета. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. 1.7.8. Остановка ферментативной реакции. В каждую лунку планшета к субстратной смеси добавляют по 50 мкл 50% серной кислоты. - 1.7.9. Регистрация результатов реакции.
Оптическую плотность субстратной смеси в каждой лунке измеряют ‘на автоматическом микрофотоэлектрокалориметре при длине волны 492 им. Количество ГТГ в каждом исследуемом образце определяют графически ло ‘калибровочной кривой, которую строят для стандартного гонадотропного гормона в координатах: по оси ординат — величина оптической плотности; по оси абсцисс— концентрация антигена.
- РАННЯЯ ЭКСПРЕСС-Д ИАГНОСТИКА ЖЕРЕБОСТИ КОБЫЛ
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО УРОВНЮ ПРОГЕСТЕРОНА В КРОВИ
2.1. Принцип и оптимальные сроки диагностики
Mero. основан на повышении уровня прогестерона в крови жеребых кобыл по сравнению с холостыми. Принции диагностики состоит в определении концентрации прогестерона сыворотки крови кобыл методом газожидкостной хроматографии. Оптимальные срохи диагностики зажеребляемости кобыл газохроматографическим методом по уровню прогестерона в крови варьируют в пределах с 16 по
23 день после слушки.
2.2. Экстрагирование стероидов ‘из ‘сыворотки крови
исследуемых кобыл Получение сыворотки крози для ‘исследований на жеребостьДляпроизводят,экстрагированиякак описаностероидовв пунктек 4 1.2.мл сыворотки, помещенной в делительную воронку, приливают 0,5 мл 11%-ного раствора гидроокиси натрия, затем добавляют 50 мл хлоро9
у
форма и смесь интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После отстоя в течение 10—15 минут и разделения фаз нижний слой хлороформа сливают в химический стакан и упари‘HJalot в термостате при температуре 70ro С.
методом тонкослойй ной 2.3. Очистка прогестерона a" xpomarorp
o I ацетатаiaгмime (1:1)илов енрастворяют в 20 мклпереносме с яти этилдля с метаноло: i : ; олени на пластины «Silufol UV 254». Одновременно на края пластины наносится для контроля 10 мкг ie ae del ‘ного раствора коммерческого препарата прогестерона. aan слойную р хроматографию проводят с О The достижe растворителеннии фронта раствор® безобе И "ПосссЕ‘де лацетатомэтого полосумо ашсо: стандартамипластинку. 110 Fochвыни-про-7 TecTepoмаюеекtaй КИСЛ} ЖИВЕЕк‘HB} al 10% -нымроявлениерастворомпластины‘пятенфосфорно-молиб-CTAaHLapTolв HULAсушиль-TOB ootт mad} в течение. 7 e!5 минут приK температуре 80°C. Foon силикагеля на уровне проявленных пятен стандартов on ° | ливаютee в мл отдельные‘метанолапробиркидва pasaи a|по минутт: us Нойпри комнат роде мл. В тика REE элюциями пробирки цент-: темпера ур при 3000 об/мин. в течение 5 минут. Затем метано/ива при температуре 70°Свсушильномшкафу. Пробыpoo! хранят| в закрытом3 виде при температуре 4°Cо до пророведения газохром,азохроматографического анализа.
2.4. Количественное определение прогестерона в пробахбах сыворотки крови кобыл
Количественное определение содержания прогестерона в пробах проводится методом газожидкостной хроматографии. Сухой осадок метанольного элюата растворяют в 20 мкл хлороформа,<: ирование5 мкл этогопроводитсяраствора т хроная,(азот) —35 мл/мин.,аа воздухтина — 400OV-1: при мл/мин,потокгаза-носителя водородyм д —x: 40250° мл/мин;С, колонкитемпература инъектора— 240°С, детектора— — 225°С. “
‘
= и \
При данных параметрах время удержания прогестерона составляет около 20 минут. Для более точного контроля используется внутреннийГм ii стандартг 1]прогестерона. Количество прогестерона в пробе определяют по калиброрввочнойсывороткекривой.крови,Кобылы,определенное, у которыхпосодержаниеданнойр методикепрогестеронав интервале с 16 по 23 день после случки, превышает уровень 6 нг/мл, считаются жеребыми, а Te, у которых концентрация прогестеронаЛ, в крови ниже 6 нт/мл.> —холостыми.ad
- ДИАГНОСТИКА ЖЕРЕБОСТИ КОБЫЛ УЛЬТРАЗВУКОВЫМ МЕТОДОМ . 3.1. Принцип метода и ‘наиболее эффективные сроки диагностики
Принцип метода основан на использовании эффекта Допплера ультразвуковой волны. В качестве регистрируемого диагпностического параметра используется пульсация ореднематочных артерий. Наиболее эффективна ультразвуковая диагностика в период 60—70ПИ д ней }послеne случки.n 3.2. Аппаратура, применяемая для ультразвуковой диагностики жеребости
Для диагностики жеребости ультразвуковым методом используются аппараты двух основных типов, предназначенные для исследования трансабдоминальным путем или ректальHPNРегистрация результатов может осуществляться либо аускультацией —по прослушиванию маточных артерий, либо визуально. При визуальном контроле проекцию на экран получают в виде эхограммы (ультразвукограммы), или в виде изображения половых путей кобылы. приВпомощиданныхприборарекомендацияхфирмы «Medata»рассматривается‘(производствадиагностикаФранции), снабжасмого при определении жеребости ректальным зондом. Диагиоз na жеребость ставится по аускультации тока крови в маточных артериях 3.3. Проведение, диагностики, ‘ультразвуковым методом
Для проведения диагностики ультразвуковойВ зонд. вводится ректально так, чтобы датчик оказался над рогами матки. Как правило, глубина введения зонда в прямую кишку составляет 35—38 см. Перед введением поверхность зонда обраИ
