1.4. Получение моноспецифической антисыворотки к ГТГ Для получения моноспецифической антисыворотки к гонадотропному TOPMOHY, сыворотку кроликоз, иммунизированных препаратом ГТГ, сорбируют на CNBr— сефарозномсорбенте, приготовленном из пула сыворотки жеребца (СЖ). CNBr—-cedaposy 4B промывают Ha стеклянном фильтре 0,001 H НС! (200 мл раствора кислоты на 1 г сефарозы) и смептивают с 0,2% раствором сыворотки крови жеребца в 1,0 М NaHCO, из расчета 5 мл раствора сыворотки жеребца na | г сефарозы. Связывание СЖ с сефарозой проволится при . мягкомтемпературеперемениванииили в течениеB течениеночи при9-х +4°.C.часов Несвязавшуюсяпри комнатной СЖ отмывают 0,1 М МаНСОз лод контролем спектрофотометpa. Отмытый сорбент инкубируют в 1 М этаноламине pH 8,0 при мятком перемешивании при комнатной температуре или в течение ночи при +4, после чего сорбент З-кратно про. мыватют поочерелно ФСБ (фосфатно-солевой буфер) с 1 м NaC! и 0,01 Н НС!с 0,5 М NaCl рН 2,2. Последняя промывка проводится ФСБ, после чего сорбент готов к работе. сушиваютДля проведенияна Бюхнеровскойиммуносорбщииворонкесуслензиюи добавляютсорбентав иммун-подную сыворотку из расчета 1 г сорбента на 10 мл сыворотки. ти С сорбентом инкубируют 30 минут в термостате (--37° С), затем 30 минут при +4 С, после чего супернатант (сорбированиая сыворотка) проверяется в иммунодиффузии } на полноту сорбции. При необходимости процедуру сорбции повторяют. Трехкратная обработка сыворотки иммуносорбентом позволяет полностью освободиться от антител к сывороточным белкам жеребца. й Опецифичность полученной антисыворотки проверяется иммуноэлектрофорезом, в котором в качестве антигена используется сыворотка жерабна, а в качестве источника антител, сорбироватная сыворотка к rr.
1.5. Наработка моноспецифических антител к ГТГ Моноспецифические антитела получают из гипериммунной сыворотки к ГТГ с помошью аффинной хроматографии на СМВг— сефарозном сорбенте с чистым гонадотропным гор‘моном. Моноспецифическую антисыворотку кролика к ГТГ пропускают через колонку с сорбентом (10 объемов сыворотки на 1 объем сорбента), а затем несвязавииеся сывороточ6
ll
whe в элюате. Элюция антител производится 0.01 H НС! с 0,15 М ные белки отмывают ФСБ с 1 М NaCl до исчезновения белка NaCl. Полученные антитела диализуют против 0,01 М карбонатного буферного раствора рН 9,6. Регенерация сорбента после элюции ‘антител завершается промыванием 0,01 М @CBc 1 М NaCl. Контролем чистоты и монослецифичности полученного препарата антител служит иммуноэлектрофорез, в котором антитела проявляют ГТГ и антисывороткой к сывороточным белкам кролика.
1.6. Получение конъюгатов антител IC ферментом пероксидазой . Получение белкового комплекса антитело-пероксидаза осуществляется периодатным окислением. Для этого 4 мг пероксидазы (RZ-3) растворяют в 1 мл листиллированной воды. К этому раствору добавляют 0.2 мл свежелриготовлениого — 0.1 MNaJO, (21,384 мг/мл) и выдерживают 20 минут при комнатнойПолученныйтемпературе.пероксидаза-альдегидный раствор диализуется против 1 М аметатного буферного раствора ФН 4,4 ночь при 4°С. После этого проводится защелачивание пероксидаза-альдегидного раствора до pH 9.0—9.5 добавлением 90 мкл 0.2 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора pH 9,5 и немедленно приливается 8 Mr антител в 1 мл 0,01 М карбонатного буфера pH 9,5. Реакционную смесь диализуют 9 часа при комнатной температуре против 0,01 М карбопатного 6ydepHoro раствора pH 9.5, после чего добавляется 0,1 мл свожеприготовлениого бортихоила (4 мг/мл) и ставится на 2 часа при 44° С. Полученный конъютат диализуют против 0,1 М фосфатноПс о левогосле диализабуферногок конъюнгатураствора pHдобавляю7,2 в т ечениебычий ночисывороточныйпри 4° С. альбуминрифугируютдо приконечной9000 об/мин.концентрации1 час при10 4°C,‘мг/мл,хранярас т воп р и цент-4°С. ля проверки антигенной и ферментативой активности конъюгата строят серии калибровочных кривых ГТГ с развелением конъюгата в дубле: 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200. За оптимальное принимается такое разведение конъюгата, при котором экстинкиия раствора в лунке с7 ‘максимальной концентрацией ГТГ равна 1,0—1,2.
1.7. Проведение иммуноферментного ‘анализа
Проведение иммуноферментного анализа выполняется в плоскодонных ‘микротитровальных полистироловых планшетах (Ленинградского завода «Медполимер», «<Limbro» (США) и др.). 1.7.1. Иммобилизация антител к ГТГ на твердую фазу B лунки микротитровального планшета вносят по 0,2 мл раствора антител в 0,01 М карбонатном буферном растворе РН 9,6 и инкубируют в течение 15—18 часов при +37°С. После иммобилизации планшеты отмывают OT несвязавшихся антител.
1.7.2. Отмывка планшетов
Содержимое лунок удаляют, и планшеты тщательно отмывают от неприсоединившегося белка сильной струей водопроводной воды. Затем лунки заполняют отмывающей жидкостью (водопроводная вода, содержащая 0,050 Твина 20). на 1,5— 2,0 минуты и вновь споласкивают струей водопроводной воды. Протелуру отмывания повторяют doesn отр a
1.7.3. Подготовка исследуемых образцов сыворотки крови Сыворотку разводят физиологическим раствором РН 7,2, содержащим 0,05% Твина 20 (концентрация белка в образце 20 мкг/мл). В планшет вносят по 200 мкл раствора сыворотки, смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение | часа.
. 1.7.4. Отмывка планшета проводится так, как указано в пункте 1.7.2.
1.7.5. Внесение в планшет конъюгата антител, меченных ферментом. Конъюгат в рабочем разведении (см. пункт 6) вносят по 200 мкл в каждую лунку планшета. Образцы в плашшете ‘инкубируют в течение | часа при 37°C. Oovierca mes , ap on “ и ие + aia планшетов проводится так же, как указано 8
