1.7. Проведение иммуноферментного ‘анализа
Проведение иммуноферментного анализа выполняется в плоскодонных ‘микротитровальных полистироловых планшетах (Ленинградского завода «Медполимер», «<Limbro» (США) и др.). 1.7.1. Иммобилизация антител к ГТГ на твердую фазу B лунки микротитровального планшета вносят по 0,2 мл раствора антител в 0,01 М карбонатном буферном растворе РН 9,6 и инкубируют в течение 15—18 часов при +37°С. После иммобилизации планшеты отмывают OT несвязавшихся антител.
1.7.2. Отмывка планшетов
Содержимое лунок удаляют, и планшеты тщательно отмывают от неприсоединившегося белка сильной струей водопроводной воды. Затем лунки заполняют отмывающей жидкостью (водопроводная вода, содержащая 0,050 Твина 20). на 1,5— 2,0 минуты и вновь споласкивают струей водопроводной воды. Протелуру отмывания повторяют doesn отр a
1.7.3. Подготовка исследуемых образцов сыворотки крови Сыворотку разводят физиологическим раствором РН 7,2, содержащим 0,05% Твина 20 (концентрация белка в образце 20 мкг/мл). В планшет вносят по 200 мкл раствора сыворотки, смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение | часа.
. 1.7.4. Отмывка планшета проводится так, как указано в пункте 1.7.2.
1.7.5. Внесение в планшет конъюгата антител, меченных ферментом. Конъюгат в рабочем разведении (см. пункт 6) вносят по 200 мкл в каждую лунку планшета. Образцы в плашшете ‘инкубируют в течение | часа при 37°C. Oovierca mes , ap on “ и ие + aia планшетов проводится так же, как указано 8
1.7.7. Внесение субстратной смеси
Субстратной смесью ‚для пероксидазы является ортофенилендиамин, растворенный в метиловом спирте. На 20 мл цитратного буферного раствора pH 4,7 берут 200 мкл смеси ортофенилендиамина -- ‘метанол и добавляют 2 мкл 30% Н.О.. Субстратную смесь B объеме 200 мкл вносят в каждую лунку планшета. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. 1.7.8. Остановка ферментативной реакции. В каждую лунку планшета к субстратной смеси добавляют по 50 мкл 50% серной кислоты. - 1.7.9. Регистрация результатов реакции.
Оптическую плотность субстратной смеси в каждой лунке измеряют ‘на автоматическом микрофотоэлектрокалориметре при длине волны 492 им. Количество ГТГ в каждом исследуемом образце определяют графически ло ‘калибровочной кривой, которую строят для стандартного гонадотропного гормона в координатах: по оси ординат — величина оптической плотности; по оси абсцисс— концентрация антигена.
- РАННЯЯ ЭКСПРЕСС-Д ИАГНОСТИКА ЖЕРЕБОСТИ КОБЫЛ
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО УРОВНЮ ПРОГЕСТЕРОНА В КРОВИ
2.1. Принцип и оптимальные сроки диагностики
Mero. основан на повышении уровня прогестерона в крови жеребых кобыл по сравнению с холостыми. Принции диагностики состоит в определении концентрации прогестерона сыворотки крови кобыл методом газожидкостной хроматографии. Оптимальные срохи диагностики зажеребляемости кобыл газохроматографическим методом по уровню прогестерона в крови варьируют в пределах с 16 по
23 день после слушки.
2.2. Экстрагирование стероидов ‘из ‘сыворотки крови
исследуемых кобыл Получение сыворотки крози для ‘исследований на жеребостьДляпроизводят,экстрагированиякак описаностероидовв пунктек 4 1.2.мл сыворотки, помещенной в делительную воронку, приливают 0,5 мл 11%-ного раствора гидроокиси натрия, затем добавляют 50 мл хлоро9
у
форма и смесь интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После отстоя в течение 10—15 минут и разделения фаз нижний слой хлороформа сливают в химический стакан и упари‘HJalot в термостате при температуре 70ro С.
методом тонкослойй ной 2.3. Очистка прогестерона a" xpomarorp
o I ацетатаiaгмime (1:1)илов енрастворяют в 20 мклпереносме с яти этилдля с метаноло: i : ; олени на пластины «Silufol UV 254». Одновременно на края пластины наносится для контроля 10 мкг ie ae del ‘ного раствора коммерческого препарата прогестерона. aan слойную р хроматографию проводят с О The достижe растворителеннии фронта раствор® безобе И "ПосссЕ‘де лацетатомэтого полосумо ашсо: стандартамипластинку. 110 Fochвыни-про-7 TecTepoмаюеекtaй КИСЛ} ЖИВЕЕк‘HB} al 10% -нымроявлениерастворомпластины‘пятенфосфорно-молиб-CTAaHLapTolв HULAсушиль-TOB ootт mad} в течение. 7 e!5 минут приK температуре 80°C. Foon силикагеля на уровне проявленных пятен стандартов on ° | ливаютee в мл отдельные‘метанолапробиркидва pasaи a|по минутт: us Нойпри комнат роде мл. В тика REE элюциями пробирки цент-: темпера ур при 3000 об/мин. в течение 5 минут. Затем метано/ива при температуре 70°Свсушильномшкафу. Пробыpoo! хранят| в закрытом3 виде при температуре 4°Cо до пророведения газохром,азохроматографического анализа.
2.4. Количественное определение прогестерона в пробахбах сыворотки крови кобыл
Количественное определение содержания прогестерона в пробах проводится методом газожидкостной хроматографии. Сухой осадок метанольного элюата растворяют в 20 мкл хлороформа,<: ирование5 мкл этогопроводитсяраствора т хроная,(азот) —35 мл/мин.,аа воздухтина — 400OV-1: при мл/мин,потокгаза-носителя водородyм д —x: 40250° мл/мин;С, колонкитемпература инъектора— 240°С, детектора— — 225°С. “
