Искусственное осеменение коз

d) Центрифугирование спермы при помощи моющего раствора

Семенная плазма у коз имеет определенные особенности состава. Одним из них является наличие белковой фракции (BUIII), производимой бульбоуретральными железами, которая взаимодействует с молочным разбавителем и вызывает подавление подвижности сперматозоидов. Для того, чтобы избежать негативные последствия этой фракции, необходимо «промыть» сперму, отделить и удалить семенную плазму путем центрифугирования до этапа смешения спермы с разбавителем.

2,8% раствор натрия цитрата (2,8 г натрия цитрата в 100 мл дистиллированной воды) может быть использован в качестве моющего раствора. рН раствора должен быть от 6,8 до 7,2. Должен проводиться периодический контроль рН-фактора моющего раствора и разбавителя.

Для разбавления семенной жидкости добавьте 10 мл моющего раствора и центрифугируйте в течение 10 минут при скорости в 2000 об/мин. Удалите всплывающую жидкость пипеткой, а затем повторите операцию так, чтобы большая часть спермы, выпавшая в осадок в нижней части трубки центрифуги, была растворена в моющем растворе. Раствор натрия цитрата должен быть добавлен при той же температуре, что и температура спермы. Поэтому первое промывание осуществляется при 36ºС, а второе, из-за снижения температуры во время центрифугирования, при 20-25ºС (лабораторная температура).

e) Первое разбавление (добавление раствора А)

Объем разбавителя для добавления в сперму рассчитывается на основе показателей, содержащихся в приложении. Из-за удаления семенной плазмы после центрифугирования, 10% вычитается из общего числа сперматозоидов, рассчитанных в эякуляте (потеря сперматозоидов при удалении всплывающей жидкости). Разбавитель А добавляется при температуре 20-25ºC.

f) Снижение температуры и время стабилизации при 5ºC

Как только разбавитель А добавлен, разбавленная сперма охлаждается с температуры разбавления до температуры 5ºC. Охлаждение производится со скоростью 2ºС за 3 минуты. Разбавленная сперма должна оставаться при этой температуре в холодильнике в течение 45-60 минут перед добавлением разбавителя B.

g) Второе разбавление (добавление раствора B)

Разбавитель B добавляется 3 равными фракциями, с 10-минутными интервалами, и смешивается каждый раз до однородности. Рекомендуется помещать пипетку в холодильник до проведения разбавления. Через десять минут после добавления последней порции раствора B сперма готова к заморозке.

h) Подготовка спермы к заморозке

Сперма может быть заморожена в соломинках в парах жидкого азота (при температуре -196ºC) или в сухих ледяных гранулах (твердый диоксид углерода при температуре -79ºC). Сперма, замороженная одним из этих двух методов, хранится в термосе с жидким азотом. Процесс замораживания в гранулах легче, чем в соломинках, но последние легче использовать индивидуально и ими легче манипулировать во время искусственного осеменения.

Важно проводить замораживание в условиях низких температур, а также обеспечивать однородные дозы спермы для получения схожего семенного качества. Особое внимание требуется при определении различных партий.

1. Замораживание спермы в гранулах

Для замораживания спермы в гранулах требуется блок сухого льда с плоской поверхностью. При помощи гвоздей, подогретых на пламени, на его поверхности формируются ячейки.

Сперму вынимают из холодильника на водяной бане при температуре 5ºC. Другой контейнер с оставшимся разбавителем, в качестве хладагента, используется для хранения стеклянных пипеток при низкой температуре.

Как только сперма аспирируется в пипетку, по 0,25 мл (± 4 капли) помещается в каждую ячейку, быстро и последовательно, стараясь не задерживаться более чем на минуту между первой и последней гранулой. Дозы спермы находятся там в течение 1-2 минут, пока их поверхность не станет непрозрачной. Затем они переносятся в термос с жидким азотом.

2. Замораживание спермы в соломинках

Соломинки, поливинильный спирт и шприц с 1,5 см иглой хранятся в холодильнике до проведения замораживания. Соломинки заполняются посредством аспирации через тройной тампон (вата – поливинильный спирт – вата); при этом конец, свободный от тампона, помещается в сперму. Соломинки держат за тампонированный конец (во избежание того, что тепло рук повлияет на качество спермы). Поливинильный спирт в тройном тампоне застудневает и герметизируется при прикосновении его с аспирированной спермой. Соломинки сушат при помощи поглощающей бумаги, и воздушное пространство длиной 1,5 см образуется на свободном от тампона конце при помощи шприца с соответствующей иглой. Этот конец затем герметично закрывается путем мягкого, вертикального постукивания по месту, содержащему поливинильный спирт. Затем соломинки немедленно погружаются в контейнер с водяной баней при температуре 5ºC.

Необходим термически изолированный ящик с крышкой, размером примерно 39 см в длину, 34 см в ширину и 25 см в высоту. Также необходимы деревянные блоки, сетка, алюминиевая рама, размером 11 см, 7 см и 2 см соответственно. Алюминиевая рама на деревянных блоках и сетка достигнут, по отношению к нижней части ящика, 20 см в высоту (1 уровень). При удалении сетки высота алюминиевой рамы на деревянных блоках достигнет 9 см (2 уровень).

Жидкий азот наливают в ящик до достижения 6 см высоты от дна. Накройте его на несколько минут до окончания «закипания» и пока не охладится внутренняя часть. После просушки соломинок их располагают горизонтально на алюминиевой раме, при этом они не должны касаться друг друга.

Соломинки на раме помещают внутри ящика на 1-м уровне на 2 минуты. Затем ящик открывают и соломинки помещают на 3 минуты на 2-й уровень (после удаления деревянных блоков).

Наконец, соломинки выливают в жидкий азот и помещают в канистры в термос с жидким азотом.

i) Размораживание и оценка партии спермы

Сперма размораживается как описано выше (см.: Обращение с замороженной спермой). После оценки 10% замороженных доз решается вопрос принятия или непринятия партии. Должны быть выполнены несколько исследований одной и той же соломинки или гранулы.

Через 5 минут после инкубации при температуре 36ºC подвижность сперматозоидов оценивается при 100-кратном увеличении с использованием разогретого предметного стекла над термической пластиной. Капля спермы помещается между нагретым предметным стеклом и крышкой для определения процента живых сперматозоидов и прогрессивной индивидуальной подвижности (скорость перемещения вперед живых сперматозоидов: минимум 0, максимум 5).

Для принятия семенной партии, соломинки или гранулы должны иметь:

• a) Масал-подвижность после размораживания. b) Долю живых сперматозоидов, превышающую 30%. c) Прогрессивную индивидуальную подвижность равную или превышающую 2,5.

• j) Размораживание спермы для искусственного осеменения

Размораживание осуществляется на водяной бане при температуре 36ºC. Содержимое каждой соломинки или гранулы выливается в гемолитическую пробирку и набирается в шприц для осеменения.