Искусственное осеменение коз

У коз он используется для двойной цели: для увеличения частоты наступления беременности, чем получаемой с помощью цервикального искусственного осеменения, а также для снижения количества сперматозоидов в каждой дозе для осеменения.

• через 45 часов после удаления губок с прогестагенами

** через 55 часов после удаления губок с прогестагенами

Хранение спермы в замороженном состоянии

Процедура замораживания спермы коз выглядит следующим образом:

a) Подготовка разбавителя спермы

Снятое порошкообразное коровье молоко разводят в дистиллированной воде (10%), например берут 50 мл дистиллированной воды на 5 г снятого молока. Разбавитель выдерживают при 92-94ºC на водяной бане в течение 10 минут. После этого его охлаждают до 36ºC и добавляют 1% глюкозы (например 0,5 г глюкозы на 50 мл разбавителя), пенициллин и стрептомицин (1000 единиц и 1 мг на 1 мл разбавителя соответственно). Получившийся объем делят на две равные части: РАЗБАВИТЕЛЬ А без добавления глицерина и РАЗБАВИТЕЛЬ B с добавлением 12% глицерина. Так, например, на 25 мл разбавителя B добавляют 3 мл глицерина. Глицерин подогревают и добавляют в разбавитель в горячем виде для получения хорошей однородности массы. Разбавитель А хранят при лабораторной температуре, а разбавитель B помещают в холодильник при 5ºC (Очень важно: температура в холодильнике не должна опускаться ниже 5ºC).

Если работы проводятся в жарких условиях, то удобно помещать раствор А в холодильник, чтобы избежать его превращения в кислоту, а затем подогревать его непосредственно перед использованием. рНфактор разбавителя должен быть в пределах между 6,8 и 7,2.

b) Сбор и оценка спермы

Сперму, собранную в искусственную вагину, держат на водяной бане при температуре 36ºC для проведения ее оценки. Каплю спермы на предметном стекле помещают на теплую поверхность на микроскопе и

рассматривают при 100-кратном увеличении. Понятие качества спермы оценивается по силе волнообразных движений (подвижности сперматозоидов) на основе того, как формируются и исчезают волны. Подвижность оценивается по субъективной шкале (минимальная: 0; максимальная: 5) на основании силы движения. Сперму замораживают только тогда, когда подвижность сперматозоидов равна или превышает 4.

Сперму необходимо постоянно защищать от резких изменений температуры, от контакта с водой или прямой солнечной радиацией, от попадания примесей. Таким образом, все материалы должны быть чистыми, сухими и поддерживаться на уровне температуры спермы.

c) Определение концентрации сперматозоидов

Этот процесс осуществляется в камере Neubauer. При загрузке камеры для подсчета сперматозоидов, должны быть предприняты следующие шаги:

• Прилепите крышку предметного стекла к камере путем увлажнения краев вазелином или слюной, плотно прижимая ее к камере. При достижении хорошего слипания, из-за дифракции света по краям крышки появятся «Кольца Ньютона».

• Наберите (аспирируйте) сперму в красную корпускульную модельную пипетку, у которой должен быть умеренный и совершенно сухой наконечник, пока не будет достигнута отметка 0,25.

• Очистите наконечник пипетки, стараясь не изменить уровень спермы.

• Аспирируйте разбавитель (это может быть обычная вода) до отметки 101.

• Закройте оба конца пипетки пальцами и осторожно потрясите горизонтально около 30 раз.

• Удалите первоначальные капли.

• Поместите наконечник пипетки на край крышки предметного стекла и дайте камере заполниться в соответствии с капиллярностью. Жидкость не должна превысить боковые углубления, не должны остаться пузырьки воздуха или пустое пространство.

• Подождите несколько минут до начала счета.

Камера также может быть заполнена микропипеткой, используя 5 микролитров спермы, разбавленных в 2 см³ воды.

Поместите камеру для ее изучения в микроскоп (имеющий от 100кратного до 200-кратного увеличения). Если распределение сперматозоидов не является однородным, то повторите процесс загрузки. Количество сперматозоидов на большой площади (без внутренних разделений) считается на квадрант, и счет повторяется в случайно выбранном квадранте, пока в общем не будет подсчитано 5 квадратов. Концентрация сперматозоидов на 1 см³ рассчитывается путем умножения общей суммы в 5 квадратах на 12 800 000.

d) Центрифугирование спермы при помощи моющего раствора

Семенная плазма у коз имеет определенные особенности состава. Одним из них является наличие белковой фракции (BUIII), производимой бульбоуретральными железами, которая взаимодействует с молочным разбавителем и вызывает подавление подвижности сперматозоидов. Для того, чтобы избежать негативные последствия этой фракции, необходимо «промыть» сперму, отделить и удалить семенную плазму путем центрифугирования до этапа смешения спермы с разбавителем.

2,8% раствор натрия цитрата (2,8 г натрия цитрата в 100 мл дистиллированной воды) может быть использован в качестве моющего раствора. рН раствора должен быть от 6,8 до 7,2. Должен проводиться периодический контроль рН-фактора моющего раствора и разбавителя.

Для разбавления семенной жидкости добавьте 10 мл моющего раствора и центрифугируйте в течение 10 минут при скорости в 2000 об/мин. Удалите всплывающую жидкость пипеткой, а затем повторите операцию так, чтобы большая часть спермы, выпавшая в осадок в нижней части трубки центрифуги, была растворена в моющем растворе. Раствор натрия цитрата должен быть добавлен при той же температуре, что и температура спермы. Поэтому первое промывание осуществляется при 36ºС, а второе, из-за снижения температуры во время центрифугирования, при 20-25ºС (лабораторная температура).

e) Первое разбавление (добавление раствора А)

Объем разбавителя для добавления в сперму рассчитывается на основе показателей, содержащихся в приложении. Из-за удаления семенной плазмы после центрифугирования, 10% вычитается из общего числа сперматозоидов, рассчитанных в эякуляте (потеря сперматозоидов при удалении всплывающей жидкости). Разбавитель А добавляется при температуре 20-25ºC.

f) Снижение температуры и время стабилизации при 5ºC

Как только разбавитель А добавлен, разбавленная сперма охлаждается с температуры разбавления до температуры 5ºC. Охлаждение производится со скоростью 2ºС за 3 минуты. Разбавленная сперма должна оставаться при этой температуре в холодильнике в течение 45-60 минут перед добавлением разбавителя B.

g) Второе разбавление (добавление раствора B)

Разбавитель B добавляется 3 равными фракциями, с 10-минутными интервалами, и смешивается каждый раз до однородности. Рекомендуется помещать пипетку в холодильник до проведения разбавления. Через десять минут после добавления последней порции раствора B сперма готова к заморозке.