так как существующие копрологические методы выявляют фасциол в организме животных лишь в половозрелой стадии.
Поэтому разработка новых методов диагностики этого заболевания особенно в ранних стадиях развития возбудителя, остается актуальной проблемой.
Для решения этого вопроса вначале была поставлена задача – изыскать метод получения антигена для реакции связывания комплемента (РСК) и получить активный и специфичный диагностикум.
При убое животных на Казанском мясокомбинате брали кровь, а также исследовали печень на наличие гельминтов методом неполного гельминтологического вскрытия. Фасциолы, собранные из желчных протоков печени крупного рогатого скота, служили материалом для получения фасциоловых антигенов. Их собрали в термос с физиологическим раствором, нагретым до 37о С. Живых гельминтов многократно промывали физиологическим раствором до полного удаления желчи и кровяных сгустков и до отсутствия опалесценции в промывочной жидкости.
Методом неполного гельминтологического вскрытия выявляли животных здоровых и инвазированных фасциолезом, дикроцелиозом и эхинококкозом и брали у них кровь. Из полученных проб крови отделяли сыворотки, которые консервировали сухой борной кислотой и хранили в холодильнике при – 5о С.
Антигены готовили разными методами. В этих целях, после последнего промывания фасциол физиологическим раствором их высушивали в термостате при 37о С.
Затем фасциол взвешивали, растирали в порошок и из него готовили 10 % суспензию на физиологическом растворе. Полученную суспензию в первом варианте подвергали 5-ти кратному замораживанию и оттаиванию, во втором – соединяли с равным объемом эфира, в третьем – с равным объемом ацетона, в четвертом – экстрагировали на диметилсульфоксиде, в пятом – подвергали ультразвуковому воздействию. В шестом варианте использовали
комбинированный метод изготовления, включающий все эти воздействия (кроме ультразвукового экстрагирования). После экстракции полученные пробы антигенов центрифугировали, надосадочную жидкость использовали в качестве диагностикума для РСК.
Разработанный нами комбинированный метод изготовления антигена, заключался в следующем. После последнего промывания фасциол в физиологическом растворе их заливали ацетон – эфиром и выдерживали при комнатной температуре. Затем смесь ацетон – эфира выливали, фасциол высушивали и растирали в порошок. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид и смесь инкубировали при 37о С. Затем добавляли физиологический раствор, доводя концентрацию суспензии до 1 % взвеси фасциол и центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость подвергали замораживанию и оттаиванию, образующийся флоккулят центрифугировали, надосадочную жидкость подвергали диализу. Полученный фасциоловый антиген консервировали мертиолятом 1:10000 и определяли его рабочий титр в РСК.
В целях стандартизации полученного антигена при экстрагировании на 1 г высушенных фасциол добавляли 100 мл физиологического раствора, а затем в нем с помощью спектрофотометра определяли количество белка. Для определения рабочего титра антигенов их разводили в соотношениях 1:10, 1:20, 1:30 и 1:40. Предельным титром антигена считали разведение, которое давало полную задержку гемолиза с наибольшим разведением позитивной фасциоловой сыворотки.
Активность полученного антигена в РСК определяли титрованием его по квадратной схеме. Для этого использовали позитивную фасциоловую сыворотку в разведениях 1:5. 1:10, 1:20 и 1:40, а также негативную сыворотку в разведениях 1:5 и 1:10.
Для контроля специфичности полученного антигена ставили РСК с сыворотками крови здорового крупного рогатого скота, а также инвазированного дикроцелиозом и эхонококкозом.
РСК на фасциолез ставили по общепринятой методике. Комплемент и гемолизин использовали в рабочих титрах, эритроциты барана – 2,5 % от осадка. Испытуемые сыворотки инактивировали в течение 30 мин при температуре 60 – 62о С.
Комплемент титровали в бактериологической системе. При массовых исследованиях сывороток РСК ставили с одной дозой сыворотки – 0,04 мл в разведение 1:5. Сыворотки, показавшие положительные и сомнительные результаты в этой реакции, переставляли до предельного титра.
Данные изучения активности фасциоловых антигенов, полученных разными методами, представлены в таблице 12.
Из таблицы видно, что наиболее активным оказался антиген, полученный комбинированным методом. Этот диагностикум с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:20 реагировал на 4 креста в разведении антигена 1:20, а с негативной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 реакция была отрицательной во всех разведениях антигена.
Антиген, полученный методом замораживания и оттаивания, также был специфичным и реагировал отрицательно с негативной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 во всех испытуемых разведениях антигена. Однако он по активности уступал первому диагностикуму. Так, в разведении позитивной сыворотки 1:20 при разведении антигена 1:20 реагировал лишь на 2 креста.
Антигены, полученные эфирным, ацетоновым и ультразвуковым экстрагированием, были наименее активными в РСК и с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:20 реагировали только на 1 крест. Кроме того, эти диагностикумы показали неспецифические результаты, то есть с негативной сывороткой в разведении 1:5 реагировали на 2 креста (антикомплементарное свойство).
Антиген, полученный методом экстрагирования
диметисульфоксидом был специфичным, но по активности также уступал
