комбинированный метод изготовления, включающий все эти воздействия (кроме ультразвукового экстрагирования). После экстракции полученные пробы антигенов центрифугировали, надосадочную жидкость использовали в качестве диагностикума для РСК.
Разработанный нами комбинированный метод изготовления антигена, заключался в следующем. После последнего промывания фасциол в физиологическом растворе их заливали ацетон – эфиром и выдерживали при комнатной температуре. Затем смесь ацетон – эфира выливали, фасциол высушивали и растирали в порошок. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид и смесь инкубировали при 37о С. Затем добавляли физиологический раствор, доводя концентрацию суспензии до 1 % взвеси фасциол и центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость подвергали замораживанию и оттаиванию, образующийся флоккулят центрифугировали, надосадочную жидкость подвергали диализу. Полученный фасциоловый антиген консервировали мертиолятом 1:10000 и определяли его рабочий титр в РСК.
В целях стандартизации полученного антигена при экстрагировании на 1 г высушенных фасциол добавляли 100 мл физиологического раствора, а затем в нем с помощью спектрофотометра определяли количество белка. Для определения рабочего титра антигенов их разводили в соотношениях 1:10, 1:20, 1:30 и 1:40. Предельным титром антигена считали разведение, которое давало полную задержку гемолиза с наибольшим разведением позитивной фасциоловой сыворотки.
Активность полученного антигена в РСК определяли титрованием его по квадратной схеме. Для этого использовали позитивную фасциоловую сыворотку в разведениях 1:5. 1:10, 1:20 и 1:40, а также негативную сыворотку в разведениях 1:5 и 1:10.
Для контроля специфичности полученного антигена ставили РСК с сыворотками крови здорового крупного рогатого скота, а также инвазированного дикроцелиозом и эхонококкозом.
РСК на фасциолез ставили по общепринятой методике. Комплемент и гемолизин использовали в рабочих титрах, эритроциты барана – 2,5 % от осадка. Испытуемые сыворотки инактивировали в течение 30 мин при температуре 60 – 62о С.
Комплемент титровали в бактериологической системе. При массовых исследованиях сывороток РСК ставили с одной дозой сыворотки – 0,04 мл в разведение 1:5. Сыворотки, показавшие положительные и сомнительные результаты в этой реакции, переставляли до предельного титра.
Данные изучения активности фасциоловых антигенов, полученных разными методами, представлены в таблице 12.
Из таблицы видно, что наиболее активным оказался антиген, полученный комбинированным методом. Этот диагностикум с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:20 реагировал на 4 креста в разведении антигена 1:20, а с негативной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 реакция была отрицательной во всех разведениях антигена.
Антиген, полученный методом замораживания и оттаивания, также был специфичным и реагировал отрицательно с негативной сывороткой в разведении 1:5 и 1:10 во всех испытуемых разведениях антигена. Однако он по активности уступал первому диагностикуму. Так, в разведении позитивной сыворотки 1:20 при разведении антигена 1:20 реагировал лишь на 2 креста.
Антигены, полученные эфирным, ацетоновым и ультразвуковым экстрагированием, были наименее активными в РСК и с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:20 реагировали только на 1 крест. Кроме того, эти диагностикумы показали неспецифические результаты, то есть с негативной сывороткой в разведении 1:5 реагировали на 2 креста (антикомплементарное свойство).
Антиген, полученный методом экстрагирования
диметисульфоксидом был специфичным, но по активности также уступал
антигенов в РСК
| № п/п | Метод приготов- ления антигена | Позитив- ная сыворот ка (титр) | Разведения антигена | Негатив- ная сыворот- ка (титр) | Разведения антигена | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1:10 1:20 1:30 1:40 | 1:10 1:20 1:30 1:40 | ||||||||||
| 1. 2. 3. 4. 5. 6. | Комбинир ованный Повторно- го замора- живания и оттаива- ния Ацетоно- вый Эфирный Ультра- звуковой Диметиль- сульфо- ксидный | 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 1:5 1:10 1:20 1:40 | ++++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ + +++ ++ ++ – ++ ++ + – +++ ++ ++ – +++ +++ ++ + | ++++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ + +++ ++ + – ++ + + – ++ ++ + – +++ +++ ++ – | ++++ ++++ ++++ ++ ++ ++ + + ++ + – – + – – – + + – – ++ ++ + – | ++++ ++++ ++++ + – + – – – – – – – – – – + – – – – – – – | 1:5 1:10 1:5 1:10 1:5 1:10 1:5 1:10 1:5 1:10 1:5 1:10 | – – – – ++ – ++ – ++ – – – | – – – – ++ – ++ – ++ – – – | – – – – + – + – + – – – | – – – – – – – – – – – – |
