Таким образом, проведенные нами исследования показали, что комбинированный метод экстрагирования позволяет получить активный и специфичный фасциоловый антиген для постановки реакции связывания комплемента.
В неблагополучном по фасциолезу хозяйстве РСК с фасциоловым антигеном намного превосходит по выявлению инвазированных животных гельминтоовоскопические методы. При этом отмечено очень низкая разрешающая способность метода последовательного промывания, который в основном принят в ветеринарных лабораториях Республики Татарстан. Для реальной оценки гельминтологической ситуации нужно проводить комплексные исследования, в том числе серологические и копрологические по усовершенствованной методике.
Следующим этапом наших исследований являлось совершенствование серологической диагностики фасциолеза путем изготовления активного и специфического антигена для реакции иммуноферментного анализа.
Материалом для получения антигена служили фасциолы из желчных ходов печени крупного рогатого скота, полученные при убое животных на мясокомбинате. Живых гельминтов многократно промывали физиологическим раствором до полного удаления желчи и кровяных сгустков и до отсутствия опалесценции в промывочной жидкости.
При убое путем неполного гельминтологического вскрытия и исследования крови определяли здоровых животных, а также инвазированных фасциолезом, дикроцелиозом и эхинококкозом. Сыворотки крови от здоровых животных служили как позитивные, а от больных дикроцелиозом и эхинококкозом для контроля специфичности полученных фасциоловых диагностикумов.
Антигены из фасциол готовили разными методами. Первая технологическая модификация заключалась в следующем. После последнего промывания фасциол физиологическим раствором их помещали в ацетон –
90
эфир в равном соотношении и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. После смесь ацетон – эфир выливали, а фасциол высушивали. Затем их взвешивали и размельчали в ступке. Полученный порошок разводили в и бикарбонатно-карбонатном буферном растворе (БКБ) подвергали ультразвуковому воздействию.
Во втором варианте после 5-ти кратного промывания фасциол в физиологическом растворе, их высушивали в термостате при 37о С и затем растирали в ступке. Из полученного порошка готовили суспензию на физиологическом растворе в присутствии 1% тритона Х-100 и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 3 минут. Готовую суспензию переосаждали насыщенным раствором сульфата аммония и центрифугировали. В качестве антигена использовали осадок.
Третий антиген был приготовлен комбинированным методом. После последнего промывания фасциол, их помещали в ацетон – эфир в соотношении 1:1 и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Затем гельминтов высушивали в термостате при 37о С в течение 2-х часов, взвешивали и размельчали в ступке. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид (ДМСО), подогретый до 37о С, доводили концентрацию суспензии до 1% взвеси и помещали в холодильник на 24 часа. Затем суспензию центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость переливали в пробирки из толстого стекла и подвергали 5-ти кратному замораживанию и оттаиванию. Образующийся флоккулят осаждали центрифугированием. Фасциоловый экстракт диализировали против дистиллированной воды в течение суток со сменой раствора 4-5 раз и использовали в качестве антигена для ИФА.
Количество белка в антигенах определяли с помощью спектрофотометра СФ-4А при длине волны 280 нм.
Для очистки фасциолового антигена использовали метод ультрацентрифугирования с помощью ультрацентрифуги L7 Вескман.
Контролем в ИФА служили отрицательные и положительные на фасциолез сыворотки крупного рогатого скота.
Чувствительность ИФА при определении антител к возбудителю фасциолеза сравнивали с РСК, с результатами неполного гельминтологического вскрытия животных и копрологическими методами (последовательных промываний, Демидова, Котельникова-Хренова).
Специфичность ИФА при определении антител к возбудителю фасциолеза крупного рогатого скота оценивали в сравнении с сыворотками, полученными от инвазированного эхинококкозом и дикроцелиозом крупного рогатого скота.
ИФА осуществляли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, описанного Voller A. et al (1976). Антиген фиксировали на твердой фазе, после отмывания проводили инкубацию с раствором антител. Если произошло специфическое связывание антител, их количественно можно определить при помощи меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки. Постановку реакции проводили следующим образом. В лунки планшета для иммунологических реакций вносили по 100 мкл опытных и контрольных растворов антигенов в 0,01 М карбонатном буфере (рН– 9,6), по 5 лунок на каждую пробу. Инкубировали 16 – 18 часов при 20о С и антиген сливали. По окончании инкубации не связанный антиген удаляли из лунок планшета и последние трижды отмывали 0,5 М NaCl, подтитрованным 1 M K2PO4 до рН – 7,3, содержащим 0,05% твин-20. Возможные свободные места в лунках блокировали 1 % раствором яичного альбумина в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН – 7,3), содержащим 0,05% твин-20 (ТФСБ). Инкубировали пробы 1 час при 37о С или 18 часов при 4о С. Планшеты отмывали от несвязанного компонента 2 – 3 раза. В лунки наносили 200 мкл контрольных и опытных сывороток, разведенных в фосфатно-солевом буфере. Инкубировали 1 час при температуре 37о С и промывали 3 – 4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкл антивидового конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшеты в
