течение 60 мин в термостате, промывали как прежде и наносили на каждую лунку по 100 мкл свежеприготовленного раствора субстрата. В качестве субстрата использовали 0,04 % ортофенилендиамин в 0,01 М фосфатноцитратном буфере, рН 4,9 с добавлением 0,03 % Н2О2. После выдерживания планшет в течение 15 минут при температуре 37о С реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 нормального раствора Н2SO4 в каждую лунку. Оптическую плотность определяли на спектрофотометрическом счетчике. Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре Tirertek Multisken (Швейцария) при длине волны 492 НМ. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), характеризующий отношение оптической плотности опыта к оптической плотности контроля. Результат реакции считали положительным,
если коэффициент специфичности был равен 1,5 и более.
Данные изучения активности фасциоловых антигенов в ИФА, полученных разными методами, представлены в таблице 17.
Из таблицы видно, что наиболее активным оказался антиген, полученный с применением диметилсульфоксида. Этот антиген в разведении 1:100 с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:800 реагировал положительно, а с негативной сывороткой в разведении 1:200 и 1:400 реакция была отрицательной.
Антигены, полученные ультразвуковым воздействием, а также с применением тритона Х-100 были специфичными и реагировали отрицательно с негативной сывороткой в разведениях 1:200 и 1:400.
Однако по активности эти антигены уступали первому диагностикуму. Так, при разведении позитивной сыворотки 1:200 в разведении антигена 1:100 реакция была положительной, а при разведении 1:400 – отрицательной.
Таким образом, наиболее активным и специфичным фасциоловым антигеном в ИФА оказался диагностикум, полученный с применением
диметилсульфоксида, рабочим титром которого является разведение 1:100. Этот антиген мы использовали в дальнейших исследованиях.
Испытуемые сыворотки, реагирующие в разведении 1:200 – 1:800, считали как положительные.
Данные изучения специфичности фасциолового антигена отражены в таблице 18.
Из таблицы видно, что при постановке ИФА с 40 негативными пробами сывороток крови реакция была отрицательной, а 12 позитивных фасциоловых сывороток показали положительный результат. Из 10 дикроцелиозных и 10 эхинококкозных сывороток соответственно по одной также реагировали
позитивно, то есть и при ИФА не исключается возможность перекрестных реакций с фасциоловым антигеном.
Для дальнейшей очистки полученного фасциолового антигена из тотальных белковых экстрактов фасциол был применен метод ультрацентрифу гирования. Полученный в этом агрегате антигенный препарат был свободен от примесей более высокомолекулярных паразитарных антигенов и других высокомолекулярных компонентов, в том числе и белков хозяина, присутствующих в неочищенных экстрактах и проявил большую специфичность.
18. Результаты испытания специфичности фасциолового антигена (ДМСО) в ИФА
| № п/п | Сыворотка | Количество проб | Реагировали | в ИФА |
|---|---|---|---|---|
| положительно | отрицательно | |||
| 1. | Фасциолезная | 12 | 12 | – |
| 2. | Негативная | 40 | – | 40 |
| 3. | Дикроцелиозная | 10 | 1 | 9 |
| 4. | Эхинококкозная | 10 | 1 | 9 |
При исследовании сывороток крупного рогатого скота в ИФА с фасциоловым антигеном в отношении негативной сыворотки коэффициент специфичности был равен 1,5 и выше, что позволяет считать реакцию специфичной.
Для изучения диагностической эффективности ИФА в сравнении с РСК исследовали сыворотки крови крупного рогатого скота, спонтанно инвазированного фасциолезом с различной интенсивностью инвазии. Результаты исследований приведены в таблице 19.
Из таблицы видно, что при интенсинвазированности одной фасциолой из 6 животных все реагировали положительно на фасциолез. Титры антител у 2 животных составляли 1:400, а у 4-х – 1:800.
При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, инвазированных двумя фасциолами, 2 животных показали позитивный результат в титре 1:400, а 2 – в титре 1:1600.
При интенсинвазированности 3-мя фасциолами все три животных реагировали положительно: два – в титре 1:1600, а одно – 1:800. Аналогичные результаты получены при инвазированности 4 фасциолами. При этом 2 животных реагировали положительно в титре 1:1600, а одно – 1:800.
Четыре животных, спонтанно инвазированных фасциолами в
количестве
6 – 15 экземпляров также реагировали положительно, причем титры антител у них были выше и составляли у 3-х – 1:1600, а у одного – 1:3200.
Таким образом, из 22 сывороток крупного рогатого скота, спонтанно зараженного фасциолами в количестве 1 – 15 экземпляров, положительно в ИФА реагировали 20 (90,9 %), отрицательно – 2 (9,1 %). В РСК положительно реагировали 18 голов (81,8 %), сомнительно – 2 (9,1 %) и отрицательно – 2 (9,1%). Дальнейшее испытание полученного антигена в ИФА проводили с сыворотками крови крупного рогатого скота, взятого во время убоя животных на Казанском мясокомбинате. После убоя проводили
