эфир в равном соотношении и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. После смесь ацетон – эфир выливали, а фасциол высушивали. Затем их взвешивали и размельчали в ступке. Полученный порошок разводили в и бикарбонатно-карбонатном буферном растворе (БКБ) подвергали ультразвуковому воздействию.
Во втором варианте после 5-ти кратного промывания фасциол в физиологическом растворе, их высушивали в термостате при 37о С и затем растирали в ступке. Из полученного порошка готовили суспензию на физиологическом растворе в присутствии 1% тритона Х-100 и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 3 минут. Готовую суспензию переосаждали насыщенным раствором сульфата аммония и центрифугировали. В качестве антигена использовали осадок.
Третий антиген был приготовлен комбинированным методом. После последнего промывания фасциол, их помещали в ацетон – эфир в соотношении 1:1 и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Затем гельминтов высушивали в термостате при 37о С в течение 2-х часов, взвешивали и размельчали в ступке. В полученный порошок добавляли диметилсульфоксид (ДМСО), подогретый до 37о С, доводили концентрацию суспензии до 1% взвеси и помещали в холодильник на 24 часа. Затем суспензию центрифугировали. Полученную надосадочную жидкость переливали в пробирки из толстого стекла и подвергали 5-ти кратному замораживанию и оттаиванию. Образующийся флоккулят осаждали центрифугированием. Фасциоловый экстракт диализировали против дистиллированной воды в течение суток со сменой раствора 4-5 раз и использовали в качестве антигена для ИФА.
Количество белка в антигенах определяли с помощью спектрофотометра СФ-4А при длине волны 280 нм.
Для очистки фасциолового антигена использовали метод ультрацентрифугирования с помощью ультрацентрифуги L7 Вескман.
Контролем в ИФА служили отрицательные и положительные на фасциолез сыворотки крупного рогатого скота.
Чувствительность ИФА при определении антител к возбудителю фасциолеза сравнивали с РСК, с результатами неполного гельминтологического вскрытия животных и копрологическими методами (последовательных промываний, Демидова, Котельникова-Хренова).
Специфичность ИФА при определении антител к возбудителю фасциолеза крупного рогатого скота оценивали в сравнении с сыворотками, полученными от инвазированного эхинококкозом и дикроцелиозом крупного рогатого скота.
ИФА осуществляли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, описанного Voller A. et al (1976). Антиген фиксировали на твердой фазе, после отмывания проводили инкубацию с раствором антител. Если произошло специфическое связывание антител, их количественно можно определить при помощи меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки. Постановку реакции проводили следующим образом. В лунки планшета для иммунологических реакций вносили по 100 мкл опытных и контрольных растворов антигенов в 0,01 М карбонатном буфере (рН– 9,6), по 5 лунок на каждую пробу. Инкубировали 16 – 18 часов при 20о С и антиген сливали. По окончании инкубации не связанный антиген удаляли из лунок планшета и последние трижды отмывали 0,5 М NaCl, подтитрованным 1 M K2PO4 до рН – 7,3, содержащим 0,05% твин-20. Возможные свободные места в лунках блокировали 1 % раствором яичного альбумина в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН – 7,3), содержащим 0,05% твин-20 (ТФСБ). Инкубировали пробы 1 час при 37о С или 18 часов при 4о С. Планшеты отмывали от несвязанного компонента 2 – 3 раза. В лунки наносили 200 мкл контрольных и опытных сывороток, разведенных в фосфатно-солевом буфере. Инкубировали 1 час при температуре 37о С и промывали 3 – 4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкл антивидового конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшеты в
течение 60 мин в термостате, промывали как прежде и наносили на каждую лунку по 100 мкл свежеприготовленного раствора субстрата. В качестве субстрата использовали 0,04 % ортофенилендиамин в 0,01 М фосфатноцитратном буфере, рН 4,9 с добавлением 0,03 % Н2О2. После выдерживания планшет в течение 15 минут при температуре 37о С реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 нормального раствора Н2SO4 в каждую лунку. Оптическую плотность определяли на спектрофотометрическом счетчике. Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре Tirertek Multisken (Швейцария) при длине волны 492 НМ. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), характеризующий отношение оптической плотности опыта к оптической плотности контроля. Результат реакции считали положительным,
если коэффициент специфичности был равен 1,5 и более.
Данные изучения активности фасциоловых антигенов в ИФА, полученных разными методами, представлены в таблице 17.
Из таблицы видно, что наиболее активным оказался антиген, полученный с применением диметилсульфоксида. Этот антиген в разведении 1:100 с позитивной фасциоловой сывороткой в разведении 1:800 реагировал положительно, а с негативной сывороткой в разведении 1:200 и 1:400 реакция была отрицательной.
Антигены, полученные ультразвуковым воздействием, а также с применением тритона Х-100 были специфичными и реагировали отрицательно с негативной сывороткой в разведениях 1:200 и 1:400.
Однако по активности эти антигены уступали первому диагностикуму. Так, при разведении позитивной сыворотки 1:200 в разведении антигена 1:100 реакция была положительной, а при разведении 1:400 – отрицательной.
Таким образом, наиболее активным и специфичным фасциоловым антигеном в ИФА оказался диагностикум, полученный с применением
