После наведения на фокус вводят в ход лучей кольцевую диафрагму темного поля, открывают ирисовую диафрагму и, наблюдая в окуляр, медленно вращают винт кремальеры держателя конденсора, поднимая его до момента появления в поле зрения ярко светящихся контуров спермиев на темном фоне.
Однажды правильно настроенное освещение и фокусировка конденсора приемлемы для последующих серийных определений качества спермы без дополнительной настройки. Для быстрейшего наведения на фокус при смене образцов предметные стекла подбирают одинаковой толщины.
В практических условиях важно определить наличие поврежденных акросом не только на неподвижных, но и на движущихся спермиях, непосредственно участвующих в оплодотворении ооцитов, так как обладающие прямолинейно-поступательным движением половые клетки не всегда являются биологически полноценными, т. е. способными к оплодотворению.
Потеря оплодотворяющей способности нередко связана с нарушением структуры акросомы спермиев, в которой содержатся ферменты гиалуронидаза и акрозин. С целью замедления скорости их поступательного движения и вращения по продольной оси мы применили белок куриного яйца. Движение спермиев в нем замедляется настолько, что можно отчетливо различить состояние их акросом. Белок яйца бесцветный и прозрачный, имеет слоистую структуру, компоненты биологически активных веществ в нем содержатся в изотонической для спермиев концентрации.
Для оценки на предметное стекло наносят стеклянной палочкой одну маленькую каплю оттаянной спермы и рядом с ней при помощи однограммового шприца три капли из слоя жидкого белка такого же объема.
Капли белка и спермы тщательно перемешивают стек-
лянной палочкой, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при температуре 38°С. Если капли получились большие, избыток жидкости удаляют, впитывая ее в бумажный фильтр. При необходимости следует сделать новый препарат.
Показатель рефракции (пД) слоя жидкого белка лежит в пределах 1,3568-1,3590. После разбавления спермы белком в соотношении 1:3 этот показатель составляет 1,35201,3550. При таком разбавлении спермы белком в поле зрения просматривается небольшое, удобное для подсчета, число подвижных спермиев, а их движение замедляется в степени, достаточной для оценки.
У отдельных, более ослабленных спермиев, наблюдается только движение жгутиков. Подсчитывают число подвижных спермиев в поле зрения микроскопа, отдельно регистрируя с неповрежденными и частично или полностью разрушенными акросомами, а затем, в этом же поле, в таком же порядке неподвижных. Подсчет спермиев ведут в 10-15 полях зрения микроскопа, результаты оценки заносят в таблицу, а затем вычисляют их процент.
В белковой среде можно определить не только состояние акросом на движущихся и неподвижных спермиях, но и оценить их подвижность в баллах и процентах. То есть проводится комплексная оценка биологической полноценности спермы быков, включая состояние акросом спермиев. Она позволяет наиболее объективно оценить спермопродукцию производителей и прогнозировать ее оплодотворяющую способность.
Контроль за количеством спермиев с нарушенными акросомами необходимо проводить по 3-5 дозам (при наличии спорных результатов – по 10 дозам) из каждой партии замороженного среднего эякулята быка-производителя. Результаты такого анализа учитываются для определения концентрации спермиев в дозе при замораживании следующей партии от данного животного.
Пример 1. В результате проверки спермодоз с концентрацией 15 млн., полученных 1.01.2005 г. от быка № 3, установлено, что наличие поврежденных акросом имеют 25% от общего числа спермиев с ППД. В этом случае следующий, предназначенный к заморозке средний эякулят быка № 3, полученный 6.01.2005 г., необходимо разбавить с учетом получения 12 млн. спермиев с ППД в дозе (см. табл. 39).
Пример 2. Установлено, что полученные 10.02.2005 г. спермодозы от быка № 5 содержат 64 % спермиев с нарушенными акросомами. В этом случае заморозку спермодоз из полученного среднего эякулята быка № 5 17.02.2005 г. необходимо проводить с концентрацией 25 млн. спермиев с ППД в дозе (см. табл. 39).
Таким образом, осуществляется постоянный контроль за получаемой спермой от быков-производителей. Проводится корректировка ее качественной ценности. Потребителям спермопродукции (хозяйствам) может быть представлен не только более качественный товар, но и рекомендации по конкретному его применению (осеменение одной или в исключительном случае двумя дозами и т.д.).
Для самого же племпредприятия контроль, осуществляемый за состоянием акросом спермиев и изменением концентрации спермодоз от 10 до 25 млн. спермиев с ППД, не имеет существенного повышения трудовых и материальных затрат, поскольку все исследования осуществляются в существующих параметрах технологического процесса.
В результате исследований установлено, что максимально возможные вариации количественного содержания в спермодозах гамет с нарушенными акросомами достигали 60-65 % (табл. 40).
Случаи дальнейшего их увеличения достаточно редки. В этой связи предлагается не использовать последние в практике, а животных, дающих спермопродукцию с более высоким числом (66 и более %) акросомных нарушений,
