МЕТОД ОЦЕНКИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ
Оценка полиморфизма гена каппа-казеина
Для амплификации фрагмента гена CSN3 использованы праймеры: CAS1 5´ - ATA GCC AAA TAT ATC CCA ATT CAG T - 3´ CAS2 5´ - TTT ATT AAT AAG TCC ATG AAT CTT G - 3´
ПЦР-программа: «горячий старт» - 5 мин при 95 °С; 35 циклов: денатурация – 1 мин при 94 °С, отжиг – 1 мин при 58 °С, синтез – 1 мин при 72 °С; элонгация – 5 мин при 72 °С.
Длина амплифицированного фрагмента – 530 п.о.
При расщеплении продуктов амплификации рестриктазой HindIII при 37 °С идентифицированы следующие генотипы (рисунок 1):
1 2 3 4 5 6 генотип CSN3АА – фрагмент 530 п.о. (4, 6)
генотип CSN3АВ - фрагменты 530,400 и 130 п.о. (1, 2, 3) генотип CSN3ВВ – фрагменты 400 и 132 п.о. (5)
Рисунок 1 – Рестрикция амплификатов (№ 1-6) с использованием
рестриктазы HindIII
Оценка полиморфизма гена альфа-лактальбумина
Для амплификации фрагмента гена LALBA использованы праймеры: LAC 1: 5´- AAG AGT TGG ATG GAA TCA CC - 3´;
LAC 2: 5´- TTC AAA TTG CTG GCA TCA AGC - 3´
ПЦР-программа: «горячий старт» - 5 мин при 94 °С; 35 циклов: денатурация – 1 мин при 94 °С, отжиг – 1 мин при 63 °С, синтез – 1 мин при 72 °С; элонгация – 10 мин при 72 °С.
Длина амплифицированного фрагмента – 430 п.о.
При расщеплении продуктов амплификации рестриктазой MhII при 37 °С идентифицированы следующие генотипы (рисунок 2):
1 2 3 4 5 6
генотип LALBAAA – фрагмент 328 и 102 п.о. (3, 4)
генотип LALBAAВ - фрагменты 328, 211, 117 и 102 п.о. (5, 6) генотип LALBAВВ – фрагменты 211, 117 и 102 п.о. (1, 2)
Рисунок 2 – Рестрикция амплификатов (№ 1-6) с использованием
рестриктазы MhII
Оценка полиморфизма гена бета-лактоглобулина
Для амплификации фрагмента гена BLG использованы праймеры: LG 1: 5´- TGT GCT GGA CAC CGA CTA CAA AAA G - 3´
LG 2: 5´- GCT CCC GGT ATA TGA CCA CCC TCT - 3´
ПЦР-программа: «горячий старт» - 5 мин при 94 °С; 35 циклов: де-
натурация – 1 мин при 94 °С, отжиг – 1 мин при 55 °С, синтез – 1 мин при 72 °С; элонгация – 7 мин при 72 °С.
Длина амплифицированного фрагмента – 247 п.о.
При расщеплении продуктов амплификации рестриктазой HaeIII при 37 °С идентифицированы следующие генотипы (рисунок 3):
генотип BLGAA – фрагмент 148 и 99 п.о. (1, 2)
генотип BLGAВ - фрагменты 148, 99 и 74 п.о. (3, 5)
генотип BLGВВ – фрагменты 99 и 74 п.о. (4)
1 2 3 4 5<br><!-- End of picture text -->
Рисунок 3 – Рестрикция амплификатов (№ 1-5) с использованием рестриктазы HaeIII
Детекцию результатов трех этапов работы – выделения ДНК, амплификации фрагмента гена CD18 и рестрикции продуктов амплификации – осуществляют электрофоретическим методом с последующей визуализацией на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм при помощи компьютерной видеосистемы и программы VITran. В качестве маркера используют ДНК плазмиды pBR322, расщепленную рестриктазой AluI, либо рестриктазой BsuRI.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ МЕТОДА ДНК-ДИАГНОСТИКИ ГЕНОТИПОВ МОЛОЧНЫХ БЕЛКОВ
Проведен анализ генетической структуры белорусской чернопестрой породы по локусам данных генов и взаимосвязи их аллельных вариантов с воспроизводительными качествами быковпроизводителей, молочной продуктивностью коров, физикохимическими и технологическими свойствами молока. В различных половозрастных группах выявлена низкая (1,9-2,4 %) частота встречаемости аллеля CSN3В . Распределение генотипов по генам сывороточных белков следующее: BLGAA – 20,7-27,1 %, BLGAB – 46,7-49,4 %, BLGBB – 23,5-32,6 %, LALBAAA – 43,3-46,5 %, LALBAAB – 40,6-44,0 %, LALBABB – 12,7-12,9 %.
