ВВЕДЕНИЕ

Повышение уровня молочной продуктивности, качества молока и экономической эффективности его производства является основной целью разведения молочных пород крупного рогатого скота. Эффективность селекционно-племенной работы в молочном скотоводстве зависит от многих факторов: генетических, средовых, экономических. Если технологические факторы обеспечивают оптимальные режимы кормления и содержания, средовые – создают условия для проявления генотипа в фенотипе, то генетические являются одними из важнейших для получения животных с высоким наследственным потенциалом. Поэтому современная концепция селекционно-племенной работы должна включать в себя использование наряду с традиционными подходами, современных достижений в области селекции, генетики и биотехнологии.

Одним из наиболее важных экономических показателей в молочном скотоводстве является содержание белка в молоке и его структура, так как в зависимости от этого изменяются затраты сырья, времени и энергии на производство молочных продуктов. В настоящее время в молочном скотоводстве особое внимание уделяется увеличению белковомолочности, так как массовая доля белков в молоке и их структура имеют большое экономическое значение для перерабатывающей промышленности и в значительной степени определяют количество и качество выхода готовой продукции. Белки молока являются хорошо сбалансированным источником незаменимых аминокислот, особенно сывороточные белки, содержащие такие наиболее дефицитные аминокислоты, как лизин, триптофан, метионин и треонин. Кроме того, пищевые и функциональные свойства белков молока делают их значимыми компонентами для производства продуктов питания.

Разработанный метод ДНК-диагностики генотипов молочных белков крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы, основанный на использовании методов ДНК-технологий, позволяет проводить тестирование животных по локусам генов каппа-казеина (CSN3), бета-лактоглобулина (BLG) и альфа-лактальбумина (LALBA), вне зависимости от пола, возраста и стадии лактации для: оценки генетической структуры племенного поголовья республики по локусам генов молочных белков; прогнозирования молочной продуктивности племенных коров; проведения маркерсопутствующей селекции, направленной на повышение белковомолочности (на 5-10 %) с одновременным улучшением технологических свойств молока, наиболее пригодного для выработки твердых сыров и других белковомолочных продуктов; разработки программ племенной работы с белорусской черно-пестрой породой.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

ДНК-полиморфизм может быть выявлен различными способами, включая прямое определение нуклеотидной последовательности. Стандартным методом является ПЦР-ПДРФ анализ, суть которого заключается в амплификации определенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точковую мутацию, с последующим расщеплением его соответствующей эндонуклеазой, электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов, по длине которых делается вывод о генотипе животного по данному гену.

Выбор метода выделения ДНК определяется наличием исходного материала (ткань, кровь, сперма), целью исследований и необходимостью хранения образца ДНК. При проведении экспресс-анализа ДНК можно использовать готовые промышленные наборы. Срок хранения таких проб – 3-4 дня. С целью длительного хранения и использования для ряда анализов, ДНК выделяют фенольным или перхлоратным методами.

Выделение ядерной ДНК из ТКАНИ

1. 0,1 г ткани измельчают и помещают в пробирку объемом 1,5 мл.

2. Добавляют 200 мкл 1хSTE буфера.

3. В пробирку добавляют 75 мкл 10 % SDS.

4. Добавляют 10 -12 мкл протеиназы К. Хорошо перемешивают.

5. Пробу помещают в термостат на ночь при 37 ºC.

6. Добавляют к лизату 8 мкл РНКазы и инкубируют 1 час при 37 ºC.

7. В пробирку с лизатом добавляют 50 мкл 5М раствора перхлората

натрия.

1. Добавляют в пробирку 300 мкл CIA (хлороформа) и очень тщательно перемешивают.

2. Центрифугируют 10 мин при 13000 об./мин.

3. Верхнюю ДНК-содержащую фазу осторожно, не затрагивая промежуточного слоя, переносят в чистую 1,5 мл пробирку.

4. Повторяют пункты 8, 9, 10.

5. В пробирку с ДНК-содержащей фазой добавляют 600 мкл 96 % этанола, встряхивают до появления «медузы» ДНК.

6. В 0,6 мл пробирку с 300 мкл 70 % этанола с помощью дозатора перемещают ДНК.

7. Через 5-10 мин спирт удаляют и высушивают ДНК до прозрачного состояния.

8. Растворяют ДНК в буфере для хранения ДНК до концентрации 100-200 нг/мл.

Выделение ядерной ДНК из СПЕРМЫ

1. 100 мкл спермы смешивают с 400 мкл реагента А в пробирках объемом 1,5 мл и центрифугируют при 7500 об/мин 2 мин.

2. Супернатант сливают, к осадку добавляют 13 мкл 1М DTT.

3. Добавляют 150 мкл реагента В (буфера 1хSTE).

4. Добавляют 75 мкл 10 % SDS.

5. Добавляют 12 мкл протеиназы К. Хорошо перемешивают. Инкубируют 8-12 ч при 60 ºС.

6. К клеточному лизату добавляют 50 мкл 5М раствора перхлората натрия.

7. Добавляют 300 мкл CIA и очень тщательно перемешивают на вортексе.

8. Центрифугируют при 13000 об./мин 7 мин.

9. Верхнюю ДНК-содержащую фазу осторожно, не затрагивая промежуточного слоя, переносят в чистую 1,5 мл пробирку.

10. Повторяют п.п. 8, 9,10.

11. К ДНК-содержащей фазе добавляют 600 мкл 96 % спирта, встряхивают до появления «медузы» ДНК.

12. В 0,6 мл пробирку с 300 мл 79 % этанола с помощью дозатора перемещают ДНК.

13. Через 5-10 мин спирт удаляют и высушивают ДНК до прозрачного состояния.

14. Растворяют ДНК в буфере для хранения ДНК до концентрации 100-200 нг/мл.

Полученные препараты ДНК подвергают спектрофотометрическому анализу с использованием аппарата GenQuant. Все основные растворы для выделения ДНК, амплификации и рестрикции готовятся по Т. Маниатису и др.

Определение концентрации, нативности ДНК и степени ее очистки

Стандартным методом оценки концентрации ДНК является спектрофотометрический. Для этого исходный раствор ДНК разбавляют в 200-400 раз и измеряют его оптическую плотность в УФ свете сдлиной волны 260 нм. Концентрацию рассчитывают по следующей формуле:

C=OD260 x 50 x f/1000,

где OD260 – оптическая плотность раствора ДНк при длине волны 260 нм, f – фактор разбавления, 1000 – коэффициент для приведения концентраций в мкг/мкл, 50 – концентрация ДНК (мкг/мл) при OD260=1

Нативность ДНК определяют проведением электрофореза в 0,81,5%-ном агарозном геле по отсутствию «шлейфа» фрагментов ДНК и интенсивности свечения бромистого этидия в УФ-свете.