Степень очистки ДНК определяют соотношением оптических плотностей раствора ДНк при длине волны 260 и 280 нм.

Для чистых препаратов ДНК это соотношение равно 1,8-2,0.

В таблице 1 приведен состав реакционной смеси и концентрации используемых реактивов в расчете на общий объем 25 мкл. При необходимости добавляется минеральное масло. Taq-полимераза вносится после «горячего старта».

Таблица 1 – Состав реакционной смеси и концентрации и используемых реактивов

ГЕНЫ-МАРКЕРЫ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ

В современной селекции при отборе животных лучших генотипов все чаще используют отбор по признакам, которые контролируются комплексом генов или отдельными генами, сравнительно легко идентифицируемыми молекулярно-генетическими методами анализа. Принципы подбора различных типов маркеров определяются решаемыми вопросами: установлением специфических характеристик генетических структур исследуемых популяций, выяснения причин их формирования и на этой основе возможности прогнозирования продуктивных качеств.

Гены белков молока в настоящее время считаются наиболее удобными генетическими маркерами, связанными с уровнем молочной продуктивности крупного рогатого скота, и характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами, то есть генетическим полиморфизмом.

Белки молока представлены двумя основными группами – растворимой фракцией, содержащей несколько компонентов, наиболее изученным из которых являются бета-лактоглобулин и альфалактальбумин, и нерастворимой фракцией – казеинами, образующей так называемый казеиновый мицелий. Массовая доля белков в молоке

составляет 2,7-3,5 %, основную часть из которых составляют казеины – 78-85 % и сывороточные белки (бета-лактоглобулин, альфалактальбумин) – 15-22 %.

Структурные гены (CSN3, BLG и LALBA), кодирующие молочные белки, являются предметом повышенного интереса генетиков, так как установлена взаимосвязь аллельных вариантов данных генов с показателями молочной продуктивности и технологическими свойствами молока. Одним из наиболее эффективных методов, позволяющих выявлять полиморфизм таких генов, является метод ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), благодаря которому стала возможной идентификация генотипов молочных белков не только у лактирующих коров, но и у быковпроизводителей, молодняка, а также эмбрионов КРС. Выявление животных-носителей предпочтительных, с точки зрения селекции, полиморфных вариантов генов, позволит, наряду с традиционными методами селекции, проводить селекцию по генотипу – селекцию с помощью генетических маркеров (MAS-селекцию).

Ген каппа-казеина (CSN3) – один из немногих известных генов, однозначно связанный с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока. Локализован на 6 хромосоме и имеет размер 13 т.п.о. В основе белкового полиморфизма каппа-казеина, причинами которого являются единичные аминокислотные замены, лежит генетический полиморфизм последовательности гена каппа-казеина (CSN3). Все аминокислотные замены в последовательности белка, в свою очередь, обусловлены нуклеотидными заменами в соответствующей протеин-кодирующей последовательности ДНК. На сегодняшний день описано десять аллелей каппа-казеина: A, B, C, E, F, G, H, I, Х, A1. В то время как генетические варианты A и B идентифицируются с различной частотой встречаемости у всех пород крупного рогатого скота, такие аллели, как C и E – редкие для большинства европейских пород. Среди черно-пестрой и голштинской пород наиболее распространены CSN3^А и CSN3^В аллели, отличающиеся аминокислотными заменами (Thr¹³⁶ → Ile и Asp¹⁴⁸ → Ala), вызванными соответствующими точковыми мутациями в позициях 5309 (С→Т) и 5345.

По данным российских и зарубежных исследователей аллель CSN3^В связан с более высоким содержанием белка в молоке (на 0,20,4%), более высоким выходом творога и сыра (на 5-10 %), а также лучшими коагуляционными свойствами молока. В ряде исследований установлено более короткое время сычужного свертывания молока коров с генотипом CSN3^ВВ по сравнению с животными генотипа CSN3^АВ и CSN3^АА . При этом твердый сыр высокого качества был изготовлен только из молока коров с генотипом CSN3^ВВ . Это единствен-

ный белковый компонент молока, на который действует сычужный фермент.

Однако из-за довольно низкой частоты встречаемости аллеля CSN3^В у черно-пестрой породы крупного рогатого скота (до 10 %), что затрудняет отбор животных с желательными генотипами, возникла необходимость поиска других маркерных генов, ассоциированных с признаками молочной продуктивности и имеющих более высокий уровень полиморфизма.

Было установлено, что такими маркерами могут служить гены сывороточных белков – альфа-лактальбумина (LALBA) и беталактоглобулина (BLG). Эти белки при пастеризации молока денатурируются, при этом бета-лактоглобулин легко взаимодействует с мицеллами казеина, в составе которых переходит в сгусток при коагуляции белков молока.

Бета-лактоглобулин – серосодержащий белок, не осаждающийся сычужным ферментом, биологическая функция которого состоит, предположительно, в транспортной функции – переносе в кишечник железа и витаминов, а также способствовании переваривания жира у новорожденных. К важнейшим технологическим свойствам относится реакция с казеином, в результате которой изменяется тепловая стабильность молока и, кроме того, задерживается процесс сычужного свертывания.

Ген BLG расположен на 11 хромосоме и имеет 4662 п.о. К настоящему времени известны 12 аллельных вариантов. Наиболее распространенными среди черно-пестрой и голштинской пород крупного рогатого скота являются аллели BLG^A и BLG^B . При этом аллель BLG^A отличается от аллеля BLG^B аминокислотными заменами в позициях: Gly⁶⁴ → Asp и Ala¹¹⁸ →Val, соответственно.

В популяциях черно-пестрой и голштинской пород частоты встречаемости гомозиготных генотипов BLG^AA и BLG^BB составляют около 20 %. Аллель BLG^B связывают с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, большим процентом жира и лучшими параметрами казеинового коагулята, аллель BLG^A – с повышением общего удоя.

Альфа-лактальбумин является металлопротеином, содержащимся в молоке, и, главным образом, в молозиве крупного рогатого скота. Главная роль LALBA – участие в процессе синтеза лактозы (удерживает молекулу глюкозы при формировании лактозы). Ген LALBA расположен на 5 хромосоме и имеет размер 2 т.п.о. В настоящее время известно 3 аллельных варианта гена LALBA^А , LALBA^В , LALBA^С . Наиболее встречающиеся аллели – LALBA^A и LALBA^B . Вариант LALBA^B отличается от LALBA^A аминокислотной заменой в позиции Arg¹⁰ → Gln⁸ , вызванной точковой мутацией (А→G) в позиции 1689.