МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
ДНК-полиморфизм может быть выявлен различными способами, включая прямое определение нуклеотидной последовательности. Стандартным методом является ПЦР-ПДРФ анализ, суть которого заключается в амплификации определенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точковую мутацию, с последующим расщеплением его соответствующей эндонуклеазой, электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов, по длине которых делается вывод о генотипе животного по данному гену.
Выбор метода выделения ДНК определяется наличием исходного материала (ткань, кровь, сперма), целью исследований и необходимостью хранения образца ДНК. При проведении экспресс-анализа ДНК можно использовать готовые промышленные наборы. Срок хранения таких проб – 3-4 дня. С целью длительного хранения и использования для ряда анализов, ДНК выделяют фенольным или перхлоратным методами.
Выделение ядерной ДНК из ТКАНИ
-
0,1 г ткани измельчают и помещают в пробирку объемом 1,5 мл.
-
Добавляют 200 мкл 1хSTE буфера.
-
В пробирку добавляют 75 мкл 10 % SDS.
-
Добавляют 10 -12 мкл протеиназы К. Хорошо перемешивают.
-
Пробу помещают в термостат на ночь при 37 ºC.
-
Добавляют к лизату 8 мкл РНКазы и инкубируют 1 час при 37 ºC.
-
В пробирку с лизатом добавляют 50 мкл 5М раствора перхлората
натрия.
-
Добавляют в пробирку 300 мкл CIA (хлороформа) и очень тщательно перемешивают.
-
Центрифугируют 10 мин при 13000 об./мин.
-
Верхнюю ДНК-содержащую фазу осторожно, не затрагивая промежуточного слоя, переносят в чистую 1,5 мл пробирку.
-
Повторяют пункты 8, 9, 10.
-
В пробирку с ДНК-содержащей фазой добавляют 600 мкл 96 % этанола, встряхивают до появления «медузы» ДНК.
-
В 0,6 мл пробирку с 300 мкл 70 % этанола с помощью дозатора перемещают ДНК.
-
Через 5-10 мин спирт удаляют и высушивают ДНК до прозрачного состояния.
-
Растворяют ДНК в буфере для хранения ДНК до концентрации 100-200 нг/мл.
Выделение ядерной ДНК из СПЕРМЫ
-
100 мкл спермы смешивают с 400 мкл реагента А в пробирках объемом 1,5 мл и центрифугируют при 7500 об/мин 2 мин.
-
Супернатант сливают, к осадку добавляют 13 мкл 1М DTT.
-
Добавляют 150 мкл реагента В (буфера 1хSTE).
-
Добавляют 75 мкл 10 % SDS.
-
Добавляют 12 мкл протеиназы К. Хорошо перемешивают. Инкубируют 8-12 ч при 60 ºС.
-
К клеточному лизату добавляют 50 мкл 5М раствора перхлората натрия.
-
Добавляют 300 мкл CIA и очень тщательно перемешивают на вортексе.
-
Центрифугируют при 13000 об./мин 7 мин.
-
Верхнюю ДНК-содержащую фазу осторожно, не затрагивая промежуточного слоя, переносят в чистую 1,5 мл пробирку.
-
Повторяют п.п. 8, 9,10.
-
К ДНК-содержащей фазе добавляют 600 мкл 96 % спирта, встряхивают до появления «медузы» ДНК.
-
В 0,6 мл пробирку с 300 мл 79 % этанола с помощью дозатора перемещают ДНК.
-
Через 5-10 мин спирт удаляют и высушивают ДНК до прозрачного состояния.
-
Растворяют ДНК в буфере для хранения ДНК до концентрации 100-200 нг/мл.
Полученные препараты ДНК подвергают спектрофотометрическому анализу с использованием аппарата GenQuant. Все основные растворы для выделения ДНК, амплификации и рестрикции готовятся по Т. Маниатису и др.
Определение концентрации, нативности ДНК и степени ее очистки
Стандартным методом оценки концентрации ДНК является спектрофотометрический. Для этого исходный раствор ДНК разбавляют в 200-400 раз и измеряют его оптическую плотность в УФ свете сдлиной волны 260 нм. Концентрацию рассчитывают по следующей формуле:
C=OD260 x 50 x f/1000,
где OD260 – оптическая плотность раствора ДНк при длине волны 260 нм, f – фактор разбавления, 1000 – коэффициент для приведения концентраций в мкг/мкл, 50 – концентрация ДНК (мкг/мл) при OD260=1
Нативность ДНК определяют проведением электрофореза в 0,81,5%-ном агарозном геле по отсутствию «шлейфа» фрагментов ДНК и интенсивности свечения бромистого этидия в УФ-свете.
Степень очистки ДНК определяют соотношением оптических плотностей раствора ДНк при длине волны 260 и 280 нм.
Для чистых препаратов ДНК это соотношение равно 1,8-2,0.
В таблице 1 приведен состав реакционной смеси и концентрации используемых реактивов в расчете на общий объем 25 мкл. При необходимости добавляется минеральное масло. Taq-полимераза вносится после «горячего старта».
Таблица 1 – Состав реакционной смеси и концентрации и используемых реактивов
| Компоненты | Концентрация на 1 пробу |
|---|---|
| 1 х Таq-буфер с 25 мМ МgCl2 | 1 х |
| Смесь dNTP | 2-4 мМ |
| Праймер 1 | 10-25 пМ |
| Праймер 2 | 10-25 пМ |
| Таq-полимераза | 1,5 е.а. |
| ДНК | 100-200 нг |
| Н2О | До 25 мкл |
ГЕНЫ-МАРКЕРЫ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ
В современной селекции при отборе животных лучших генотипов все чаще используют отбор по признакам, которые контролируются комплексом генов или отдельными генами, сравнительно легко идентифицируемыми молекулярно-генетическими методами анализа. Принципы подбора различных типов маркеров определяются решаемыми вопросами: установлением специфических характеристик генетических структур исследуемых популяций, выяснения причин их формирования и на этой основе возможности прогнозирования продуктивных качеств.
Гены белков молока в настоящее время считаются наиболее удобными генетическими маркерами, связанными с уровнем молочной продуктивности крупного рогатого скота, и характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами, то есть генетическим полиморфизмом.
Белки молока представлены двумя основными группами – растворимой фракцией, содержащей несколько компонентов, наиболее изученным из которых являются бета-лактоглобулин и альфалактальбумин, и нерастворимой фракцией – казеинами, образующей так называемый казеиновый мицелий. Массовая доля белков в молоке
