Выделение ядерной ДНК из СПЕРМЫ

1. 100 мкл спермы смешивают с 400 мкл реагента А в пробирках объемом 1,5 мл и центрифугируют при 7500 об/мин 2 мин.

2. Супернатант сливают, к осадку добавляют 13 мкл 1М DTT.

3. Добавляют 150 мкл реагента В (буфера 1хSTE).

4. Добавляют 75 мкл 10 % SDS.

5. Добавляют 12 мкл протеиназы К. Хорошо перемешивают. Инкубируют 8-12 ч при 60 ºС.

6. К клеточному лизату добавляют 50 мкл 5М раствора перхлората натрия.

7. Добавляют 300 мкл CIA и очень тщательно перемешивают на вортексе.

8. Центрифугируют при 13000 об./мин 7 мин.

9. Верхнюю ДНК-содержащую фазу осторожно, не затрагивая промежуточного слоя, переносят в чистую 1,5 мл пробирку.

10. Повторяют п.п. 8, 9,10.

11. К ДНК-содержащей фазе добавляют 600 мкл 96 % спирта, встряхивают до появления «медузы» ДНК.

12. В 0,6 мл пробирку с 300 мл 79 % этанола с помощью дозатора перемещают ДНК.

13. Через 5-10 мин спирт удаляют и высушивают ДНК до прозрачного состояния.

14. Растворяют ДНК в буфере для хранения ДНК до концентрации 100-200 нг/мл.

Полученные препараты ДНК подвергают спектрофотометрическому анализу с использованием аппарата GenQuant. Все основные растворы для выделения ДНК, амплификации и рестрикции готовятся по Т. Маниатису и др.

Определение концентрации, нативности ДНК и степени ее очистки

Стандартным методом оценки концентрации ДНК является спектрофотометрический. Для этого исходный раствор ДНК разбавляют в 200-400 раз и измеряют его оптическую плотность в УФ свете сдлиной волны 260 нм. Концентрацию рассчитывают по следующей формуле:

C=OD260 x 50 x f/1000,

где OD260 – оптическая плотность раствора ДНк при длине волны 260 нм, f – фактор разбавления, 1000 – коэффициент для приведения концентраций в мкг/мкл, 50 – концентрация ДНК (мкг/мл) при OD260=1

Нативность ДНК определяют проведением электрофореза в 0,81,5%-ном агарозном геле по отсутствию «шлейфа» фрагментов ДНК и интенсивности свечения бромистого этидия в УФ-свете.

Степень очистки ДНК определяют соотношением оптических плотностей раствора ДНк при длине волны 260 и 280 нм.

Для чистых препаратов ДНК это соотношение равно 1,8-2,0.

В таблице 1 приведен состав реакционной смеси и концентрации используемых реактивов в расчете на общий объем 25 мкл. При необходимости добавляется минеральное масло. Taq-полимераза вносится после «горячего старта».

Таблица 1 – Состав реакционной смеси и концентрации и используемых реактивов

ГЕНЫ-МАРКЕРЫ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ

В современной селекции при отборе животных лучших генотипов все чаще используют отбор по признакам, которые контролируются комплексом генов или отдельными генами, сравнительно легко идентифицируемыми молекулярно-генетическими методами анализа. Принципы подбора различных типов маркеров определяются решаемыми вопросами: установлением специфических характеристик генетических структур исследуемых популяций, выяснения причин их формирования и на этой основе возможности прогнозирования продуктивных качеств.

Гены белков молока в настоящее время считаются наиболее удобными генетическими маркерами, связанными с уровнем молочной продуктивности крупного рогатого скота, и характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами, то есть генетическим полиморфизмом.

Белки молока представлены двумя основными группами – растворимой фракцией, содержащей несколько компонентов, наиболее изученным из которых являются бета-лактоглобулин и альфалактальбумин, и нерастворимой фракцией – казеинами, образующей так называемый казеиновый мицелий. Массовая доля белков в молоке

составляет 2,7-3,5 %, основную часть из которых составляют казеины – 78-85 % и сывороточные белки (бета-лактоглобулин, альфалактальбумин) – 15-22 %.

Структурные гены (CSN3, BLG и LALBA), кодирующие молочные белки, являются предметом повышенного интереса генетиков, так как установлена взаимосвязь аллельных вариантов данных генов с показателями молочной продуктивности и технологическими свойствами молока. Одним из наиболее эффективных методов, позволяющих выявлять полиморфизм таких генов, является метод ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), благодаря которому стала возможной идентификация генотипов молочных белков не только у лактирующих коров, но и у быковпроизводителей, молодняка, а также эмбрионов КРС. Выявление животных-носителей предпочтительных, с точки зрения селекции, полиморфных вариантов генов, позволит, наряду с традиционными методами селекции, проводить селекцию по генотипу – селекцию с помощью генетических маркеров (MAS-селекцию).

Ген каппа-казеина (CSN3) – один из немногих известных генов, однозначно связанный с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока. Локализован на 6 хромосоме и имеет размер 13 т.п.о. В основе белкового полиморфизма каппа-казеина, причинами которого являются единичные аминокислотные замены, лежит генетический полиморфизм последовательности гена каппа-казеина (CSN3). Все аминокислотные замены в последовательности белка, в свою очередь, обусловлены нуклеотидными заменами в соответствующей протеин-кодирующей последовательности ДНК. На сегодняшний день описано десять аллелей каппа-казеина: A, B, C, E, F, G, H, I, Х, A1. В то время как генетические варианты A и B идентифицируются с различной частотой встречаемости у всех пород крупного рогатого скота, такие аллели, как C и E – редкие для большинства европейских пород. Среди черно-пестрой и голштинской пород наиболее распространены CSN3^А и CSN3^В аллели, отличающиеся аминокислотными заменами (Thr¹³⁶ → Ile и Asp¹⁴⁸ → Ala), вызванными соответствующими точковыми мутациями в позициях 5309 (С→Т) и 5345.

По данным российских и зарубежных исследователей аллель CSN3^В связан с более высоким содержанием белка в молоке (на 0,20,4%), более высоким выходом творога и сыра (на 5-10 %), а также лучшими коагуляционными свойствами молока. В ряде исследований установлено более короткое время сычужного свертывания молока коров с генотипом CSN3^ВВ по сравнению с животными генотипа CSN3^АВ и CSN3^АА . При этом твердый сыр высокого качества был изготовлен только из молока коров с генотипом CSN3^ВВ . Это единствен-