ll
whe в элюате. Элюция антител производится 0.01 H НС! с 0,15 М ные белки отмывают ФСБ с 1 М NaCl до исчезновения белка NaCl. Полученные антитела диализуют против 0,01 М карбонатного буферного раствора рН 9,6. Регенерация сорбента после элюции ‘антител завершается промыванием 0,01 М @CBc 1 М NaCl. Контролем чистоты и монослецифичности полученного препарата антител служит иммуноэлектрофорез, в котором антитела проявляют ГТГ и антисывороткой к сывороточным белкам кролика.
1.6. Получение конъюгатов антител IC ферментом пероксидазой . Получение белкового комплекса антитело-пероксидаза осуществляется периодатным окислением. Для этого 4 мг пероксидазы (RZ-3) растворяют в 1 мл листиллированной воды. К этому раствору добавляют 0.2 мл свежелриготовлениого — 0.1 MNaJO, (21,384 мг/мл) и выдерживают 20 минут при комнатнойПолученныйтемпературе.пероксидаза-альдегидный раствор диализуется против 1 М аметатного буферного раствора ФН 4,4 ночь при 4°С. После этого проводится защелачивание пероксидаза-альдегидного раствора до pH 9.0—9.5 добавлением 90 мкл 0.2 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора pH 9,5 и немедленно приливается 8 Mr антител в 1 мл 0,01 М карбонатного буфера pH 9,5. Реакционную смесь диализуют 9 часа при комнатной температуре против 0,01 М карбопатного 6ydepHoro раствора pH 9.5, после чего добавляется 0,1 мл свожеприготовлениого бортихоила (4 мг/мл) и ставится на 2 часа при 44° С. Полученный конъютат диализуют против 0,1 М фосфатноПс о левогосле диализабуферногок конъюнгатураствора pHдобавляю7,2 в т ечениебычий ночисывороточныйпри 4° С. альбуминрифугируютдо приконечной9000 об/мин.концентрации1 час при10 4°C,‘мг/мл,хранярас т воп р и цент-4°С. ля проверки антигенной и ферментативой активности конъюгата строят серии калибровочных кривых ГТГ с развелением конъюгата в дубле: 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200. За оптимальное принимается такое разведение конъюгата, при котором экстинкиия раствора в лунке с7 ‘максимальной концентрацией ГТГ равна 1,0—1,2.
1.7. Проведение иммуноферментного ‘анализа
Проведение иммуноферментного анализа выполняется в плоскодонных ‘микротитровальных полистироловых планшетах (Ленинградского завода «Медполимер», «<Limbro» (США) и др.). 1.7.1. Иммобилизация антител к ГТГ на твердую фазу B лунки микротитровального планшета вносят по 0,2 мл раствора антител в 0,01 М карбонатном буферном растворе РН 9,6 и инкубируют в течение 15—18 часов при +37°С. После иммобилизации планшеты отмывают OT несвязавшихся антител.
1.7.2. Отмывка планшетов
Содержимое лунок удаляют, и планшеты тщательно отмывают от неприсоединившегося белка сильной струей водопроводной воды. Затем лунки заполняют отмывающей жидкостью (водопроводная вода, содержащая 0,050 Твина 20). на 1,5— 2,0 минуты и вновь споласкивают струей водопроводной воды. Протелуру отмывания повторяют doesn отр a
1.7.3. Подготовка исследуемых образцов сыворотки крови Сыворотку разводят физиологическим раствором РН 7,2, содержащим 0,05% Твина 20 (концентрация белка в образце 20 мкг/мл). В планшет вносят по 200 мкл раствора сыворотки, смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение | часа.
. 1.7.4. Отмывка планшета проводится так, как указано в пункте 1.7.2.
1.7.5. Внесение в планшет конъюгата антител, меченных ферментом. Конъюгат в рабочем разведении (см. пункт 6) вносят по 200 мкл в каждую лунку планшета. Образцы в плашшете ‘инкубируют в течение | часа при 37°C. Oovierca mes , ap on “ и ие + aia планшетов проводится так же, как указано 8
1.7.7. Внесение субстратной смеси
Субстратной смесью ‚для пероксидазы является ортофенилендиамин, растворенный в метиловом спирте. На 20 мл цитратного буферного раствора pH 4,7 берут 200 мкл смеси ортофенилендиамина -- ‘метанол и добавляют 2 мкл 30% Н.О.. Субстратную смесь B объеме 200 мкл вносят в каждую лунку планшета. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. 1.7.8. Остановка ферментативной реакции. В каждую лунку планшета к субстратной смеси добавляют по 50 мкл 50% серной кислоты. - 1.7.9. Регистрация результатов реакции.
Оптическую плотность субстратной смеси в каждой лунке измеряют ‘на автоматическом микрофотоэлектрокалориметре при длине волны 492 им. Количество ГТГ в каждом исследуемом образце определяют графически ло ‘калибровочной кривой, которую строят для стандартного гонадотропного гормона в координатах: по оси ординат — величина оптической плотности; по оси абсцисс— концентрация антигена.
- РАННЯЯ ЭКСПРЕСС-Д ИАГНОСТИКА ЖЕРЕБОСТИ КОБЫЛ
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО УРОВНЮ ПРОГЕСТЕРОНА В КРОВИ
2.1. Принцип и оптимальные сроки диагностики
Mero. основан на повышении уровня прогестерона в крови жеребых кобыл по сравнению с холостыми. Принции диагностики состоит в определении концентрации прогестерона сыворотки крови кобыл методом газожидкостной хроматографии. Оптимальные срохи диагностики зажеребляемости кобыл газохроматографическим методом по уровню прогестерона в крови варьируют в пределах с 16 по
23 день после слушки.
2.2. Экстрагирование стероидов ‘из ‘сыворотки крови
исследуемых кобыл Получение сыворотки крози для ‘исследований на жеребостьДляпроизводят,экстрагированиякак описаностероидовв пунктек 4 1.2.мл сыворотки, помещенной в делительную воронку, приливают 0,5 мл 11%-ного раствора гидроокиси натрия, затем добавляют 50 мл хлоро9
у
