Таблица 1 - Классификация ооцит-кумулюсных комплексов
| № п/п | Морфологические признаки | Оценка |
|---|---|---|
| 1 | Многослойный компактный кумулюс (не менее 3-х слоев) плотно прилегающий к зоне пеллюцида, ооплазма мелкозернистая, равномерно заполняет прозрачную оболочку, которая равномерная по толщине, апполисцирует, не имеет никаких нарушений, округлая по форме | 5 |
| 2 | Многослойный компактный или разрыхленный кумулюс, плотно прилегающий к зоне пеллюцида, ооплазма имеет участки гранулярной конденсации, прозрачная оболочка округлая, апполисцирующая, не имеет дефектов, равномерная по толщине | 4 |
| 3 | Частично отслоившийся кумулюс, ооплазма имеет участки гранулярной конденсации, прозрачная оболочка равномерная по толщине, округлая по форме | 3 |
| 4 | Ооцит без кумулюса, ооплазма мелкозернистая, равномерно заполняет зону пеллюцида, прозрачная оболочка округлая, равномерная по толщине | 2 |
Продолжительность дозревания ооцит-кумулюсных комплексов составляет 24 часа. Все манипуляции с клетками проводят или с помощью оттянутых стерильных пастеровских пипеток или же с использованием стандартных заводских пипеток Unopette Оценка качества и зрелости ооцита по его морфолоческому состоянию как правило субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита очень часто встречается асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток кумулюса. Однако, другие методы оценки могут привести к повреждению ооцита и его гибели.
СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТ-КУМУЛЮСНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Среды, используемые для созревания ооцитов могут быть самыми разными Ham΄s F-10, МЕМ, SOF, Игла и ряд других: однако все они должны отвечать одному требованию: обеспечить качественное созревание ооцитов до стадии оплодотворения (MII). В настоящее время наиболее широко используемой комплексной средой созревания является ТСМ-199 с солями Игла, L – глютамином и 25 мМ Hepes (таблица 2). Непосредственно перед постановкой на культивирования она обогащается 10-20% эстральной сыворотки крупного рогатого скота, или сывороткой плодов коровы в том же объеме, бычьим сывороточным альбумином в концентрации 60 мг/мл, ФСГ-1-10 и эстрадиолом 1-5 мкг/мл Дозревание ооцитов проходит в
условиях инкубатора при концентрации СО2 - 5%, температуре 37-390 С и максимальной влажности 95-98% в течение 24 часов в чашках Петри Ø 40 мм, культуральных 5-ти луночных планшетах или же в каплях среды от 5 до 50 мкл под минеральным маслом.
Таблица 2 – Состав питательной среды ТСМ-199
| Компоненты | г/л | Компоненты | г/л |
|---|---|---|---|
| Calcium Chloride | 0,2 | Choline Chloride | 0,0005 |
| Ferric Nitrate · 9H2O | 0,00072 | Folic Acid | 0,00001 |
| Magnesium Sulfate | 0,09767 | Menadione (sodium bisulfite) | 0,000016 |
| Potassium Chloride | 0,4 | myo-Inositol | 0,00005 |
| Sodium Acetate | 0,05 | Niacinamide | 0,000025 |
| Sodium Chloride | 6,0 | Nicotinic Acid | 0,000025 |
| Sodium Phosphate Monobasic | 0,122 | p-Aminobenzoic Acid | 0,00005 |
| Alanine | 0,025 | D-Pantothenic Acid | 0,00001 |
| Arginine · HCl | 0,07 | Pyridoxal · HCl | 0,000025 |
| Aspartic Acid | 0,03 | Pyridoxine · HCl | 0,000025 |
| Cysteine · HCl · H2O | 0,00011 | Retinol Acetate | 0,00014 |
| Cystine · 2HCl | 0,026 | Riboflavin | 0,00001 |
| Glutamic Acid | 0,0668 | Tocopherol Phosphate · 2Na | 0,00001 |
| Glutamine | 0,1 | Thiamine HCl | 0,00001 |
| Glycine | 0,05 | Adenine Hemisulfate | 0,01 |
| Histidine · HCl · H2O | 0,02188 | Adenine 5’-Triphosphate · 2Na | 0,001 |
| Hydroxy-L-Proline | 0,01 | Adenosine 5’-Monophosphate · Na | 0,0002385 |
| Isoleucine | 0,02 | Cholesterol | 0,0002 |
| Leucine | 0,06 | 2-Deoxy-ribose | 0,0005 |
| Lysine · HCl | 0,07 | Glucose | 1,0 |
| Methionine | 0,015 | Glutathione | 0,00005 |
| Phenylalanine | 0,025 | Guanine · HCl | 0,0003 |
| Proline | 0,04 | HEPES | 5,958 |
| Serine | 0,025 | Hypoxanthine | 0,0003 |
| Threonine | 0,03 | Phenol Red · Na | 0,0213 |
| Tryptophan | 0,01 | Polyoxyethylenesorbitan Monooleate | 0,02 |
| Tyrosine · 2Na · 2H2O | 0,05766 | Ribose | 0,0005 |
| Valine | 0,025 | Thymine | 0,0003 |
| Ascorbic Acid Na | 0,00005666 | Uracil | 0,0003 |
| Biotin | 0,00001 | Xanthine · Na | 0,000344 |
| Ergocalciferol | 0,0001 |
ПОДГОТОВКА СПЕРМЫ К ОПЛОДОТВОРЕНИЮ. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ
Оплодотворение представляет собой слияние двух гамет, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом и развитие нового организма. В процессе оплодотворения различают три фазы: 1) дистантное взаимодействие и сближение гамет; 2) контактное взаимодействие и активизация яйцеклетки; 3) вхождение сперматозоида в яйцо и последующее слияние — сингамия.
Первая фаза — дистантное взаимодействие — обеспечивается хемотаксисом — совокупностью специфических факторов, повышающих вероятность столкновения половых клеток.
Вторая фаза оплодотворения — контактное взаимодействие, во время которого сперматозоиды вращают яйцеклетку. Многочисленные спермии приближаются к яйцеклетке и вступают в контакт с ее оболочкой. Яйцеклетка начинает совершать вращательные движения вокруг своей оси со скоростью 4 вращения в минуту. Эти движения обусловлены влиянием биения жгутиков сперматозоидов и продолжаются около 12 ч.
Третья фаза - в ооплазму проникают головка и промежуточная часть хвостового отдела. После вхождения сперматозоида в яйцеклетку на периферии ооплазмы происходит уплотнение ее (зонная реакция) и образуется оболочка оплодотворения.
Кортикальная реакция — слияние плазмолеммы яйцеклетки с мембранами кортикальных гранул, в результате чего содержимое из гранул выходит в перивителиновое пространство и воздействует на молекулы гликопротеидов блестящей зоны (рисунок 12). Вследствие этой зонной реакции молекулы зоны пеллюцида модифицируются и утрачивают способность быть рецепторами спермиев. Образуется оболочка оплодотворения толщиной 50 нм, препятствующая полиспермии — проникновению других спермиев.
После сближения женского и мужского пронуклеусов, которое продолжается у млекопитающих около 12 ч, образуется зигота — одноклеточный зародыш (рисунок 11). Уже на стадии зиготы выявляются презумптивные зоны (лат. presumptio — вероятность, предположение) как источники развития соответствующих участков бластулы, из которых в дальнейшем формируются зародышевые листки. Зрелый ооцит к моменту оплодотворения представляет собой одну из наиболее больших клеток организма диаметром 110-120 мкм, окружению блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями
