Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота

два раза отмывается в среде как и в случае применения методики swimup.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ

Культивирование ранних зародышей - это развитие оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) до стадии морулы или бластоцисты (приложение 2,3). Культивирование предусматривает использование различных культуральных систем и проводится по нескольким направлениям: в условиях in vitro это происходит в синтетических питательных средах с или без использования монослойных культур различных видов соматических клеток (яйцеводов, гранулезы, трофобластов и др.) Однако такая система требует определенных подходов, навыков и времени при подготовке монослойных культур, что создает определенные сложности. Кроме этого такие среды характеризуются значительной вариабельностью своей биологической активности из-за непостоянства состава. В связи с этим, в последнее время пристальное внимание со стороны специалистов уделяется использованию синтетических питательных сред с четко определенным составом (так называемые «defined medium») без использования каких либо натуральных добавок и этих же сред, но с использованием различных вариантов сыворотки крови крупного рогатого скота, сыворотки плодов коровы и BSA (бычий сывороточный альбумин) (так называемые «semi defined medium»). Несмотря на несколько более низкую эффективность такие среды, и в частности SOF (синтетическая среда яйцеводов), получили достаточно широкое применение, особенно при широкомасштабном получении эмбрионов на коммерческой основе.

В сложившейся ситуации нами предлагается следующий вариант культивирования ранних зародышей: после оплодотворения зиготы три-четыре раза отмываются от спермы в среде для культивирования и пересаживаются в ту же среду в которой они созревали. К этому времени в ней начинает расти монослой из клеток кумулюса, оставшегося в среде после пептирования ооцитов при переносе их в среду для оплодотворения. В этих условиях зародыши культивируются в течении 7-9 дней, до предимплантационных стадий.

Динамика развития эмбрионов отражена в таблице 3.

Как видно из данных таблицы 2, через 96 часов после оплодотворения в культуральной среде присутствуют 2-х, 4-х, 8-ми, и 16-ти клеточные зародыши. Ранние и поздние морулы, а также ранние бластоцисты появляются через 120 часов. Через 192 часа в среде обнаруживаются поздние и экспандированные бластоцисты, а через 264 часа – вышедшие из зоны пеллюцида. Наличие в питательной среде на каждый конкретный момент времени эмбрионов на разных стадиях развития свидетельствует о не одномоментности оплодотворения яйцеклеток.

ПЕРЕЧЕНЬ НЕОБХОДИМОГО ОБОРУДОВАНИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И РЕАКТИВОВ (приложение 4)

1. Стереоскопический микроскоп. 2. Инвертированный микроскоп. 3. СО2 – инкубатор.

2. Микроцентрифуга. 5. Аналитические весы.

3. Сушильный шкаф. 7. Термостат. 8. Холодильник-морозильник. 9. Лабораторные столы. 10. Предметные и покровные стекла.

4. Химическая посуда (стаканы, колбы, цилиндры разного объема. 12. Микродозаторы на 1-10 мкл и 10-100 мкл. 13. Пробирки «Эпиндорф» объемом 1,5-2,0 мл.

5. Чашки «Петри» стеклянные и пластмассовые диаметром 90 и 40 мм.

6. Чашки культуральные 5-ти луночные.

7. Фильтры и фильтровальные мембраны.

8. Хирургические инструменты (ножницы, скальпели, зажимы, и др.).

9. Сосуды Дьюара (50 л, 20 л и 5 л). 19. Замораживатель эмбрионов.

10. Шприцы одноразовые ( 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл и 20 мл). 21. Спиртовки. 22. Вата хирургическая.

11. Маркеры. 24. Спирт.