Рисунок 13 – Схематичное изображение акросомной реакции
Попадая в перевелитиновое пространство, сперматозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита комплиментарными рецепторами. Связывание сперматозоида с рецепторами мгновенно вызывает т.н. кортикальную реакцию – массовый экзоцитоз гранул, что приводит к необратимым изменениям зоны пеллюцида, делающих его непроходимой для других спермиев. Далее начинается слияние мембран, сперматозоид как бы заглатывается ооцитом (процесс напоминает фагоцитоз). Далее ядерная мембрана сперматозоида разрушается. Ооцит активизируется, мейоз возобновляется, выделяется второе полярное тельце. (фактор активизации выделяется сперматозоидом). Формируется женский пронуклеус. Вокруг хроматина сперматозоида формируется мужской пронуклеус. Начиная движение друг к другу они встречаются в центре ооцита. Через несколько часов мембраны пронуклеусов разрушаются и генетический материал обоих клеток сливается (сингамия). На этом процесс оплодотворения завершается – возникает зигота.
Подготовка спермы к оплодотворению может проходить по двум направлениям: с использованием метода «swim-up» и с использованием Перколла.
При использовании метода swim-up одна пайета спермы аккуратно наслаивается на дно центрифужной пробирки Эпиндорф с 1 мл среды (рисунок 14) для капацитации и ставится на 60 мин в СО2инкубатор. За это время активная фракция спермы всплывает в верхнюю часть. Через час надосадочная жидкость отсасывается и помещается в другую пробирку и центрифугируется (рисунок 15) в течении 10 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочная жидкость удаляется, а осадок разбавляется средой для капацитации с гепарином в концентрации 5 мкг/мл и центрифугируется в том же режиме. Далее супернатант удалялся, а осадок разбавлялся дважды и дважды центрифугировался со средой для оплодотворения (1 мл). Пока сперма центрифугируется в последний раз. Ооциты отмываются в среде для оплодотворения и помещается в лунку с этой же средой после чего к ним добавляется сперма в концентрации 1 млн./мл (рисунок 16). Совместное инкубирование продолжается в течение 18-20 часов, после чего ооциты отмываются от среды для оплодотворения и помещаются в среду для культивирования ранних зародышей на монослой кумулюсных клеток, где зародыши созревают до предимплантационной стадии.
Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение метода центрифугирования в градиенте Перколла. Перколл представляет собой суспензию силиконовых гранул диаметром 15-30 нм покрытых слоем поливинилпиролидона (PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколла является его очень низкая осмолярность – 25 м осм/л, поэтому при разведении в среде до различных концентраций, соответствующих различным плотностям (от 1.01. до 1.13 г/л) осмолярность растворов остается постоянной.
Растворы (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9 частей Перколла, 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки. Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40% Перколла на 1,5 мл 90% в конической пробирке: сверху аккуратно наслаивается сперма (одна доза). Вся эта трехслойная колонка центрифугируется при 3000 об/мин в течении 10 мин. После центрифугирования в осадок попадает только функционально нормальные сперматозоиды: неподвижные и аномальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермы задерживаются на границе 40 и 90% -х фракций. Осадок отбирается и
