Ионный состав .
Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды для культивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли собой модификацию раствора Кребса и содержал ионы, необходимые для поддержания жизни клеток – Na+ , К+ , Са+2 , Mg+2 , PO43, и Cl-, растворенные в бикарбонатном буфере (НСО3).
Источник белка .
В качестве источника белка в основном используется бычий сывороточный альбумин, эстральная сыворотка или же сыворотка плодов коровы.
Энергетический субстрат .
Энергетическим субстратом для ооцитов и эмбрионов млекопитающих в культуральной среде обычно содержит пируват натрия, лактат натрия и глюкоза, при этом усвоение глюкозы начинается только после нескольких делений эмбриона. До этого основным источником энергии является пируват. Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется их присутствием в жидкости яйцеводов. Однако при введении в среду аминокислот следует иметь ввиду, что не все они стабильны в условиях культивирования. При температуре 370 С многие из них разрушаются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладает токсическим эффектом.
ОТБОР ДОНОРОВ ООЦИТОВ
Донор - это животное высокой племенной ценности. Поэтому в первую очередь при его отборе учитывается молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта породы а в нашем случае не ниже 9000 кг молока за лактацию с содержанием жира не ниже чем 3,8% и белка не ниже 3,5%. Число учитываемых признаков может быть расширено и дополнительно включать такие показатели как пригодность к машинному доению, форма вымени, скорость молокоотдачи, крепость конституции, экстерьер и т.д. Племенная ценность донора наряду с оценкой собственного генотипа должна подтверждаться соответствующими показателями родителей и ближайших родственников.
ПОЛУЧЕНИЯ ООЦИТ-КУМУЛЮСНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Ооцит-кумулюсные комплексы можно получать по двум направлениям.
Первое – получение ооцитов из яичников коров, убитых на мясокомбинате (для испытания и контроля питательных сред, отработки методик).
После убоя животного, яичники овариоктамируется с помощью ножниц, помещаются в один из растворов: физраствор, раствор Хенкса или же буфер Дюльбекко и при температуре 32-360 С доставляются в лабораторию (приложение 1, А). По нашим данным наилучшие время доставки - до 3 часов. При этом выход Мо-Вl составлял 19-27,3% от числа ооцитов поставленных на созревание. Увеличение длительности кратковременного хранения до 6,0 часов сокращает данный показатель на 9,8-13,2%, до 9 часов на 15,8-17,9%. Кратковременное хранение яичников свыше 9 часов при данной температуре исключает возможность получения эмбрионов на предимплантационной стадии развития.
Поэтому при доставке яичников в лаборатории через шесть часов и более желательно использовать раствор с температурой 20250 С. При это выход морул и бластоциста сохраняется на уровне 2126,8% (3,1-6,0 часов) и 18,2 и 22,2% при длительности хранения 9-12 часов.
В лаборатории яичники освобождаются от соединительной ткани и дважды промываются в свежем растворе, после чего начинается процедура выделения ооцитов. Она может проходить по следующим направлениям: надрез стенки фолликула, рассечение ткани яичников и аспирация (рисунки 2-4).
В наших опытах более эффективным по выходу жизнеспособных клеток оказался надрез стенок фолликулов - 53,4% против 46,3 и 49,2% при рассечении ткани яичников и аспирации. Однако из-за большей простоты и более высокого общего выхода ооцитов (на 31-31,8%) более приемлемым является рассечение ткани яичников.
