для каждой амипокислоты при данном подвижном растворителе.
Элюирование пятен. Из проявленной хроматограммы вырезают пятна, содержащие по одной аминокислоте, измельчают и помещают в пробирки. В каждую наливают no 5 мл 75%-ного этилового спирта и ставят в темноту на один час. Колориметрируют на ФЭК-М при зеленом светофильтре в кювете против контроля (элюат фона).
Плотность каждой аминокислоты гидролизата сравнивают с плотностями их в смеси-«свидетеле», где известно количество каждой аминокислоты. Концентрацию
аминокислот рассчитывают по формуле:
‚ 100ХАХЭ. ХИ, ХУ. XS <9;%laxY, ' где Х — содержание аминокислоты (г% па сырое А —пнавескавещество)свидетеля; (г); В — павеска вещества (г); П, — объем наносимого «свидетеля»; I],Э, —— экстинцияобъем наносимогоданной вещества;аминокислоты в «свидеЭ, — экстинциятеле»; данной, аминокислоты в гидролиУ, — зате;объем разведения «свидетеля»; У, — объем разведения гидролизата. ся наСодержание16 г азота.аминокислот в тканях пересчитываетПри помощи данного метода можно количественно определять свободные аминокислоты белковых гидролизатов крови, мочи, экстрактов из тканей и других биологических жидкостей, содержащих 0,05—0,20 мгМ каждой аминокислоты. Метод применим для всех аминокислот, за исключением пролина и оксипролина, которые образуют с нингидрином соединение красного цвета, при нагревании переходящее в производное желтого цвета. Пятна пролина и оксипролипа проявляют раствором 0,2%-noro изатина в ацетоне. Пятна этих аминокислот после прогревания при 70—75° в атмосфере, насыщеппой парами воды, приобретают голубую окраску.
‘ В связи с тем что триптофан разрушается при кислотном гидролизе полностью, для ero определения образец гидрелизуют раствором щелочи, а его количество определяют химическим методом (см. стр. 49). f
Свободные аминокислоты
Свободные аминокислоты во многих биологических материалах содержатся в незначительных концентрациях по сравнению с другими компонентами. Поэтому образец частично очищают. Обычио хроматографическому анализу препятствуют белки, липиды, неорганические соли, сахара и мочевина. В зависимости от материала содержание их бывает разным. Кровь. Часто определяют содержание свободных аминокислот в плазме крови. Для получения ee кровь стабилизируют антикоагулянтами: на 20 мл крови добавляют гепарина 100—200 ед., герудина 1%-ного 8 капель, 25%-noro щавелевокислого натрия или калия и 10% -пого натрия лимоннокислого по 0,5 мл. Далее кровь центрифугируют 15 минут при 3000 об/мии, плазму сливают и используют для анализа. Плазму можно’ получить отстаиванием гепаринизированной крови в холодильнике в течение 24 часов с последующим отсасыванием верхнего слоя. Для получения свободных аминокислот плазмы необходимо осадить белок. Существует много способов осаждения белков: 0,04 г раствора уксусной кислоты с последующим кипячением; 3—5%-ным раствором трихлоруксуспой кислоты; этанолом (4—9 частей этанола 96° на одну часть ткани); безводным подкисленным ацетоном; 10%-ным вольфрамовокислым натрием и др. При этом происходит некоторая потеря аминокислот. Выход ux составляет ие больше 85—90% общего а-аминного азота плазмы крови. Несколько больший выход аминокислот отмечен при осаждении белков плазмы 1%-ным раствором пикриновой кислоты (Штейн и Мур, 1954). Вместе с белками пикриповая кислота связывает и липиды, ло сравнению с ацетоном ce обезжиривающее действие полнее. Приготовление 1%-ного раствора пикриновой кислоты несколько затруднепо в связи с плохой растворимостью в холодной воде. Поэтому ее готовят заранее, растворяя в воде с помощью магнитной мешалки. Для осаждения белков в плазме
6!
достаточно B3ATb пятикратный объем 1% -пой пикриновой кислоты, тщательно перемешать полученную эмульсию и отцентрифугировать в течение 10 минут при' 9500 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить и' освободить от пикриновой кислоты, пропуская ее через: колонку с нопообменной смолой Дауэкс 2X8 в хлоридной форме. Длина колонки 30 em, диаметр 2—4 см, толщинадочиойслояжидкостисмолычерез6—8 смолусм. Послепоследнююпропусканияпадо промыть:надоса0,02 н. соляной кислотой по 3 мл пятикратно. Фильтрат выпаривают на водяной бане до объема 1 мл, смывают 10%-ным изопропиловым спиртом до определенного’ объема и фильтруют через бумажный фильтр. Объем окончательного разведения зависит от величипы исходпого образца. В полученном таким образом безбелковом фильтрате можно определить аминокислоты методом бумажной хроматографии. Цельную кровь или изолированные эритроциты сначала подвергают гемолизу, а затем обрабатывают так же,Количественноекак и плазму. определение свободных аминокислот и аминокислот гидролизата одинаковы. В безбелковых фильтратах крови на бумажной хроматограмме можно определить триптофан, который полностью разрушается после кислотного гидролиза, а также орнитин, тауPMH, цитруллин, аминомасляную кислоту, которые не обнаруживаются после гидролиза. Ткань. Получить безбелковый фильтрат из любой ткани можно этим же способом, предварительно приготовив тканевой гомогепат. В процессе автолиза быстро увеличивается количество свободных аминокислот. Поэтомуморозить исследуемый(лучше всегоорганжидкимрекомепдуетсявоздухом) сначалаи депротеи-занизировать еще перел оттаиванием. Впутренние органы дают особенно сильпые пятна таурипа, этаноламипофосфорной кислоты и глютатиона. К наиболее сильтым пятнам небелковой фракции мозга относятся пятна соенинений. биохимически близкие к тлютамиповой кислоте, глютамипу и аминомасляной кислоте. Таким образом. методом одномерной бумажной хроматографии в безбелковых фильтратах различного биологического материала можно количественио определять следуюние аминокислоты: цистин, орнитии, лизин, ти-
