В таблице 1 указана динамика развития эмбрионов in vitro и in vivo.
Таблица 1 – Динамика развития эмбрионов in vitro и in vivo
| Стадия развития | Время развития, ч | |
|---|---|---|
| in vitro | in vivo | |
| 2-клеточные | 15-24 | 24-72 |
| 4-клеточные | 35-40 | 48-72 |
| 8-клеточные | 45-50 | 72-120 |
| 16-клеточные | 45-50 | 96-120 |
| Мо I | 120-144 | 120-144 |
| Мо II | 120-172 | 120-168 |
| Бл I | 120-172 | 168-192 |
| Бл II | 192-216 | 168-216 |
| Бл III | 192-216 | 192-240 |
| Бл IV, V | 264 | 216-264 |
2. ОБЩИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА КЛЕТОК
Оценка состояния зародышей служит для отбора неоплодотворенных яйцеклеток и определения стадии развития эмбрионов, а также выявления повреждений отдельных бластомеров или всего эмбриона. Морфологическая оценка является основным методом определения качества клеток. При этом учитываются основные морфологические признаки полноценности зародышей, которые могут визуально наблюдаться у эмбриона, а именно: целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность перивителинового пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствии стадии развития возрасту эмбриона. Частицы на поверхности зоны пеллюцида указывают на возможность бактериального заражения. Часто при инфицировании половых органов доноров яйцеклетки остаются неоплодотворенными. Различия в величине между бластомерами в пределах
2:1 оцениваются как нормальные, так как к исследованию попадают эмбрионы при различной последовательности циклов деления. Более сильные различия величины (4:1 и больше) возникают, если отдельные бластомеры прекращают деление. Сжатие бластомеров - это в большинстве случаев последствие гипертонических нагрузок. Деформация возникает при измененном внутреннем давлении клеток, или в результате дефектов в клеточных мембранах.
По результатам оценки делается заключение о качестве эмбриона и принимается решение о его дальнейшем использовании.
3. ООЦИТЫ И ЯЙЦЕКЛЕТКИ
3.1 МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ IN VITRO
Использование технологии in vitro с достаточной эффективностью невозможно без определения способности половых клеток к полноценному созреванию и оплодотворению. Одним из классических способов определения жизнеспособности ооцитов считается оценка их морфологического состояния с использованием прижизненной микроскопии.
Популяция выделенных фолликулярных ооцитов является весьма неоднородной как по морфологии, так и по функциональному состоянию. У 30% всех яйцеклеток выявляются видимые признаки дегенерации: сжатие или фрагментация ооплазмы, увеличение перивителинового пространства, отслоение или полное отсутствие кумулюса; деформированная, неравномерная по толщине прозрачная оболочка и др. Остальные клетки можно считать пригодными для культивирования, однако при цитогенетическом анализе ооцитов после 24 часов культивирования обнаруживается около 80% зрелых, пригодных к оплодотворению яйцеклеток.
В организме самки ооциты созревают в фолликуле. Тесная связь ооцита и окружающих его кумулюсных клеток обеспечивает его нормальное развитие и созревание.
По состоянию кумулюса яйцеклетки можно подразделить на следующие группы:
-
Ооциты с компактным, многослойным, плотно прилегающим к ооциту, кумулюсом.
-
Ооциты с разрыхленным многослойным кумулюсом.
-
Ооциты с разрыхленным, частично отслоившимся кумулюсом или в виде разрозненных участков, покрывающих ооцит.
Ооплазму у ооцита можно охарактеризовать по следующим признакам:
-
Мелкозернистая, равномерно заполняющая пространство под прозрачной оболочкой.
-
Ооплазма с участками гранулярной конденсации, равномерно заполняющая пространство под прозрачной оболочкой.
Прозрачная оболочка, обеспечивающая связь внутренних структур ооцита с внешней средой, характеризуется следующими данными: опалесцирующая, равномерная по ширине, округлой формы.
Из морфологической оценки качества вышеперечисленных структур слагается общая оценка качества ооциткумулюсного комплекса и его способности к дальнейшему развитию и созреванию (таблица 2). Популяцию полученных ооциткумулюсных комплексов рекомендуется разделять на группы по следующим морфологическим признакам:
1 группа - компактный, многослойный, плотно прилегающий к ооциту кумулюс; ооплазма мелкозернистая, равномерно заполняющая пространство под прозрачной оболочкой;
2 группа - компактный, многослойный, плотно прилегающий к ооциту кумулюс; ооплазма имеет участки гранулярной конденсации;
3 группа - разрыхленный многослойный кумулюс; ооплазма имеет участки гранулярной конденсации;
4 группа - частично отслоившийся рыхлый кумулюс; ооплазма с гранулярной конденсацией;
5 группа - ооциты без кумулюса с мелкозернистой ооплазмой, равномерно заполняющей пространство под прозрачной оболочкой.
