Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота

условиях инкубатора при концентрации СО2 - 5%, температуре 37-39⁰ С и максимальной влажности 95-98% в течение 24 часов в чашках Петри Ø 40 мм, культуральных 5-ти луночных планшетах или же в каплях среды от 5 до 50 мкл под минеральным маслом.

Таблица 2 – Состав питательной среды ТСМ-199

ПОДГОТОВКА СПЕРМЫ К ОПЛОДОТВОРЕНИЮ. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ

Оплодотворение представляет собой слияние двух гамет, влекущее за собой слияние их гаплоидных наборов хромосом и развитие нового организма. В процессе оплодотворения различают три фазы: 1) дистантное взаимодействие и сближение гамет; 2) контактное взаимодействие и активизация яйцеклетки; 3) вхождение сперматозоида в яйцо и последующее слияние — сингамия.

Первая фаза — дистантное взаимодействие — обеспечивается хемотаксисом — совокупностью специфических факторов, повышающих вероятность столкновения половых клеток.

Вторая фаза оплодотворения — контактное взаимодействие, во время которого сперматозоиды вращают яйцеклетку. Многочисленные спермии приближаются к яйцеклетке и вступают в контакт с ее оболочкой. Яйцеклетка начинает совершать вращательные движения вокруг своей оси со скоростью 4 вращения в минуту. Эти движения обусловлены влиянием биения жгутиков сперматозоидов и продолжаются около 12 ч.

Третья фаза - в ооплазму проникают головка и промежуточная часть хвостового отдела. После вхождения сперматозоида в яйцеклетку на периферии ооплазмы происходит уплотнение ее (зонная реакция) и образуется оболочка оплодотворения.

Кортикальная реакция — слияние плазмолеммы яйцеклетки с мембранами кортикальных гранул, в результате чего содержимое из гранул выходит в перивителиновое пространство и воздействует на молекулы гликопротеидов блестящей зоны (рисунок 12). Вследствие этой зонной реакции молекулы зоны пеллюцида модифицируются и утрачивают способность быть рецепторами спермиев. Образуется оболочка оплодотворения толщиной 50 нм, препятствующая полиспермии — проникновению других спермиев.

После сближения женского и мужского пронуклеусов, которое продолжается у млекопитающих около 12 ч, образуется зигота — одноклеточный зародыш (рисунок 11). Уже на стадии зиготы выявляются презумптивные зоны (лат. presumptio — вероятность, предположение) как источники развития соответствующих участков бластулы, из которых в дальнейшем формируются зародышевые листки. Зрелый ооцит к моменту оплодотворения представляет собой одну из наиболее больших клеток организма диаметром 110-120 мкм, окружению блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими слоями

клеток кумулюса. К этому времени в ооците, как правило, уже завершилось первое мейотическое деление мейоза, в результате которого отделилось первое полярное тельце, а второе деление находится на стадии метафазы. Хромосомы располагаются в ряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под полярным тельцем. На этой стадии происходит блок мейоза, который снимается лишь при проникновении сперматозоида.

Зрелый сперматозоид имеет уплощенную грушевидную головку длиной около 6 мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм состоящую главным образом из ядра и акросомы, которая содержит литические ферменты и расположена в виде шапочки над верхней половиной головки (рисунок 10). Хвост сперматозоида имеет длину около 50 мкм и начинается от головки в районе шейки, где расположены центриоль и комплекс митохондрий. В структуре сперматозоида все имеет только одну цель – доставить генетический материал, содержащийся в головке спермия в ооцит. Способность сперматозоида к оплодотворению in vivo или же in vitro появляется лишь после капацитации, под которой понимается весь комплекс биохимических и ультраструктурных изменений, которые претерпевает сперматозоид, проходя через женский половой тракт до встречи с ооцитом. Эти изменения затрагивают в основном мембрану головки сперматозоида. Капацитация in vitro проходит во время обработки и инкубирования спермы до оплодотворения, однако она невозможна при отсутствии в средах для отмывки и культивирования альбумина. Для нормального оплодотворения in vitro необходим не менее 50 тыс. сперматозоидов на ооцит, однако количество спермиев непосредственно атакующих ооцит насчитывается не более 2-3 тыс.

Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид должен преодолеть несколько барьеров (рисунок 12). Первым из них является кумулюс, представляющий собой матрикс, состоящий из полигиалуроновой кислоты, с редко расположенными клетками. Пройти этот барьер может только капацитированный сперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь кумулюса поведение сперматозоида меняется, резко увеличивается скорость, двухмерные движения становятся трехмерным – наступает фаза гиперактивности in vitro. Преодолеть первый барьер сперматозоидам помогает фермент гиалоуронидаза , выделяющаяся при разрушении акросом гибнущих сперматозоидов. После прохождения кумулюса сперматозоид достигает зоны пеллюцида, где происходит его связывании с рецептором. Связывание сперматозоида возможно только при