пронуклеус; 11 — мужской пронуклеус; 12 — синкарион; 13 — первое митотическое деление зиготы; 14 — бластомеры.
1, 2, 3, 4 — стадии акросомной реакции; 5 — zona pellucida (блестящая зона); 6 — перивителиновое пространство; 7 — плазматическая мембрана; 8 — кортикальная гранула; 8а — кортикальная реакция; 9 — вхождение спермия в яйцеклетку; 10 — зонная реакция.
Затем происходит акросомная реакция (рисунок 13) – мембрана акросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы (главным образом фермент акросомы, способный к локальному растворению гликопротеинов из клеток которых состоит зона пеллюцида ) выбрасывается вместе связывания с зоной пеллюцида и сперматозоид интенсивно продвигаясь сквозь оболочку ооцита, все еще находится в состоянии гиперактивности.
а – интактная сперма
б – сперма в процессе слияния плазмы и наружной акросомальной мембраны
Рисунок 13 – Схематичное изображение акросомной реакции
Попадая в перевелитиновое пространство, сперматозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита комплиментарными рецепторами. Связывание сперматозоида с рецепторами мгновенно вызывает т.н. кортикальную реакцию – массовый экзоцитоз гранул, что приводит к необратимым изменениям зоны пеллюцида, делающих его непроходимой для других спермиев. Далее начинается слияние мембран, сперматозоид как бы заглатывается ооцитом (процесс напоминает фагоцитоз). Далее ядерная мембрана сперматозоида разрушается. Ооцит активизируется, мейоз возобновляется, выделяется второе полярное тельце. (фактор активизации выделяется сперматозоидом). Формируется женский пронуклеус. Вокруг хроматина сперматозоида формируется мужской пронуклеус. Начиная движение друг к другу они встречаются в центре ооцита. Через несколько часов мембраны пронуклеусов разрушаются и генетический материал обоих клеток сливается (сингамия). На этом процесс оплодотворения завершается – возникает зигота.
Подготовка спермы к оплодотворению может проходить по двум направлениям: с использованием метода «swim-up» и с использованием Перколла.
При использовании метода swim-up одна пайета спермы аккуратно наслаивается на дно центрифужной пробирки Эпиндорф с 1 мл среды (рисунок 14) для капацитации и ставится на 60 мин в СО2инкубатор. За это время активная фракция спермы всплывает в верхнюю часть. Через час надосадочная жидкость отсасывается и помещается в другую пробирку и центрифугируется (рисунок 15) в течении 10 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочная жидкость удаляется, а осадок разбавляется средой для капацитации с гепарином в концентрации 5 мкг/мл и центрифугируется в том же режиме. Далее супернатант удалялся, а осадок разбавлялся дважды и дважды центрифугировался со средой для оплодотворения (1 мл). Пока сперма центрифугируется в последний раз. Ооциты отмываются в среде для оплодотворения и помещается в лунку с этой же средой после чего к ним добавляется сперма в концентрации 1 млн./мл (рисунок 16). Совместное инкубирование продолжается в течение 18-20 часов, после чего ооциты отмываются от среды для оплодотворения и помещаются в среду для культивирования ранних зародышей на монослой кумулюсных клеток, где зародыши созревают до предимплантационной стадии.
