Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение метода центрифугирования в градиенте Перколла. Перколл представляет собой суспензию силиконовых гранул диаметром 15-30 нм покрытых слоем поливинилпиролидона (PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколла является его очень низкая осмолярность – 25 м осм/л, поэтому при разведении в среде до различных концентраций, соответствующих различным плотностям (от 1.01. до 1.13 г/л) осмолярность растворов остается постоянной.
Растворы (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9 частей Перколла, 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки. Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40% Перколла на 1,5 мл 90% в конической пробирке: сверху аккуратно наслаивается сперма (одна доза). Вся эта трехслойная колонка центрифугируется при 3000 об/мин в течении 10 мин. После центрифугирования в осадок попадает только функционально нормальные сперматозоиды: неподвижные и аномальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермы задерживаются на границе 40 и 90% -х фракций. Осадок отбирается и
два раза отмывается в среде как и в случае применения методики swimup.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ
Культивирование ранних зародышей - это развитие оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) до стадии морулы или бластоцисты (приложение 2,3). Культивирование предусматривает использование различных культуральных систем и проводится по нескольким направлениям: в условиях in vitro это происходит в синтетических питательных средах с или без использования монослойных культур различных видов соматических клеток (яйцеводов, гранулезы, трофобластов и др.) Однако такая система требует определенных подходов, навыков и времени при подготовке монослойных культур, что создает определенные сложности. Кроме этого такие среды характеризуются значительной вариабельностью своей биологической активности из-за непостоянства состава. В связи с этим, в последнее время пристальное внимание со стороны специалистов уделяется использованию синтетических питательных сред с четко определенным составом (так называемые «defined medium») без использования каких либо натуральных добавок и этих же сред, но с использованием различных вариантов сыворотки крови крупного рогатого скота, сыворотки плодов коровы и BSA (бычий сывороточный альбумин) (так называемые «semi defined medium»). Несмотря на несколько более низкую эффективность такие среды, и в частности SOF (синтетическая среда яйцеводов), получили достаточно широкое применение, особенно при широкомасштабном получении эмбрионов на коммерческой основе.
В сложившейся ситуации нами предлагается следующий вариант культивирования ранних зародышей: после оплодотворения зиготы три-четыре раза отмываются от спермы в среде для культивирования и пересаживаются в ту же среду в которой они созревали. К этому времени в ней начинает расти монослой из клеток кумулюса, оставшегося в среде после пептирования ооцитов при переносе их в среду для оплодотворения. В этих условиях зародыши культивируются в течении 7-9 дней, до предимплантационных стадий.
Динамика развития эмбрионов отражена в таблице 3.
