Поясним сущность этих двух процессов ири помощи схематического изображения (рис. 2). В процессе адсорбции молекулы растворенного вещества концентрируются на открытой поверхности частиц адсорбента. Скорость адсорбции веществ при прохож дении раствора через колонку зависит от адеорбционной их активности. Наиболее активные вещества адсорби руются быстро в верхней части колонки, а менее актив ные — в нижней. Многие вещества растворяются в несмешивающихся растворителях. Например, аминокислоты растворяются
растворителях. Например, аминокислоты растворяются МЛС: Ja СА.a = ввомводеспирте.и в бутило-Если к Я быть, ух раствору аминокисЕ UR: Res 30. лоты в воде доба ge PE № prem a BHTb бутилового НА a ce в спирта, часть молса i ae 4 29 кул аминокислоты жа SE ЗЕ yas: ee перейдет из воды в А ь бутанол. Если одии ИЗ растворителей, рис.адсорбции2. Схемалическое(А) и распределенияизображениемежнапример воду, cAeду жидкими фазами (Б). лать пеподвижным I — нодвнжиая Gaza: лее. (слева) MENON (неподвижная фавижная фаза; п (Справа) ситель — твердый ко за), то ири продви неподвижной жидкой фазы, жении второй фазы растворенное в пей вещество целиком перейдет в неподвижную фазу— Boду и сконцентрируется в определенном месте согласпо закону распределения. (Б)Этотрисункапроцесс2, гдеиллюстрируетсявода, адсорбируясьна правойна поверхностиполовине частиц адсорбента, стала неподвижной фазой, извлекающей молекулы растворенного вещества из проходящей подвижной фазы, TO есть бутанола. На принципе распределения веществ между фазами основала бумажнаястоитХроматографияхроматографияиз волокон клетчаткиаминокислотвеществ, разнойв томна бумаге.числевеличины,аминокислот.Бумагапа кото-сорых могут адсорбироваться молекулы растворенного вещества или растворителя. Вследствие этого бумагу соответствующих сортов стали применять в хроматографическом анализе смесей веществ в растворе, в том числе и аминокислот.
Ч
Ч
При любом методе хроматографии определяют толь‚ ко свободные аминокислоты. В общих чертах схема количественного определения аминокислот в биологических объектах (корма, кровь, мясо, молоко и т. д.) методом хроматографии на бумаге следующая. Ha хроматографическую бумагу, на расстоянии 6—8 см от края, пипеткой паносяг пробу гидролизата, содержащую амивокислот около | мг. Край бумаги, около которого нанеcell гидролизат, погружают в растворитель. Если погружают верхний край бумаги, то растворитель, пропитывая бумагу, будет стекать вниз. Такая хроматография пазывается нисходящей. Ссли же в раствор погружен нижний край бумаги и растворитель будет подниматься по ней вверх, хроматография называется восходящей. В том и другом случае растворитель, продвигаясь по бумаге, растворяет содержащиеся в образце аминокислоты. Они движутся по бумаге с разной скоростью в зависимости от скорости движения растворителя. Отношение скорости движения аминокислоты к скорости движения растворителя величина для каждой аминокислоты постоянная. Это отношение называется постоянной ПОДВИЖНОСТИ И обозначается символом RI. При прохождеиии растворителя по бумаге аминокислоты разделяются в соответствии с их Rf. Поэтому, когда разделение прекратится, растворитель испарится и бумагу смочат нингидрииом, па ней появляются расположенные в ряд, окрашенные в фиолетовый, фиолетово-синий и близкие к UHM цвета пятна, каждое из которых представляет скоплепие окрашенных молекул той или иной аминокислоты. Это и есть хроматограмма ружить,аминокислот.разделить,Хроматографиейа затем и количественнопа бумаге можноопределитьобнадо 18 аминокислот, находящихся одновременно в одном растворе. Степень окраски пятен пропорциональна содержанию в пих аминокислот. Определить содержапие любой амипокислотыпятенменно пробырядомможно,си ней,стапдартнойнлисравииваяфотометрически,смеси,интепсивностьнаносимойсмываяодновре-окраскикаждую аминокислоту с пятна, вырезапиого из хроматограммы. По показателю экстинции фотометра содержание амипокислоты устанавливают при помоши стандартной кривой, изготовлеппой для каждой аминокислоты заранее.
53
Часто аминокислоты с близким зиачепием ВТ при первом хроматографировании дают общее пятно. Чтобы разделить такие аминокислоты, тот же растворитель пропускают два и больше раз или же используют другой растворитель. Для разделения аминокислот, образующих общие WITHA ири одпомериом хроматографировании, то есть при пропускапин раствортеля только в одном направлении, применяют двухмериое хроматографирование, то есть в двух перпендикулярных друг другу направлениях. Диля этого бумагу с одпомерной хроматограммой поме-
реке 8 щаютемв лодочкум сарас=e У во eropbitl —=Е^—}pe тому краю, i | % был погружен в рас име hepuom Rpesad@rpatin uy a YE р “I atl ; ровании. Оборудование для гПе" | хроматографии аминоeeamaй 2 ществуеткислот на бумаге.много Cy- BH| ee дов хроматографичеРис, ских камер, одна из 3. Хроматографическая камера: HHX, предназначенная ee камеры его парами Лодовдля нисходящей хрокаToneкой 2 укрепленаeC наОйстоликеион3. Листы Р, Матографии,На рисунке 3. показанаПри Boc4 Фронт нисходящей фазы на бу ходящей хроматограMare обозначен цифрой 6. фии лодочка в камере камеры.жную фазуНа рисункеналивают4 показаныв сосуд, которыйнемикропипеткитребуется,м ставятадляпаподви-днонанесения проб гидролизата на бумагу Точность расчета, а следовательно, и определения аминокислот методом хроматографии па бумаге во миогом зависит от правильного взятия пробы. Концентрация испытываемых веществ должна быть слабой и объем пробы небольшой. Поэтому требуется Touran калибровка микропипеток и аккуратное нанесение образца па бумагу. Обычно удовлетворительпые результаты получают при пользовании пипетками, применяемыми для анализа крови. Для удобства часто микропипетку у
