ды, реагирующие с пингидрином. Исходное пятно должно быть небольшим, и при количественном определении размер его и объем наносимого раствора должны быть везде абсолютно одинаковыми. Если размеры наносимого пятна на хроматограмме слишком велики, то пятна стапут размытыми и приобретут пеопределенную форму. Места нанесения хорошо подсушивают на воздухе при комнатной температуре, после чего скрепляют по шесть листов вместе стеклянными палочками и помещают в хроматографическую камеру.
Для приготовления искусственной смеси аминокислот-«свидетелей» берут специальные наборы амииокислот, предварительно подсушивают их в эксикаторе. Чтобы повысить точность анализа, количество каждой аминокислоты в «свидетеле» должно приблизительно соответствовать содержанию ее в гидролизате. Поэтому для каждой ткани составляют свой «свидетель». Для этого на ряд листов хроматографической бумаги одновременно наносят несколько проб разных гидролизатов и смесей-‹свидетелей» в различных концентрациях. После этого визуально находят наиболее близкие по концентрации пятна каждой аминокислоты-«свидетеля» и гидролизатов. Таким образом добиваются, чтобы разница в экстинции «свидетеля» и гидролизата была в пределах 10—15%. Так, например, для гидролизатов крови свиней в в 10 мл искусственной смеси содержалось аминокислот (в мг): цистина 3,8, лизина 10,4, гистидина 6,3, аргинина 7,6, аспарагиновой кислоты 10,0, серина 9,6, глицина 8,2, глютаминовой кислоты 10,7, треонина 7,7, аланина 14,0, пролина 11,1, тирозина 6,3, метионина 5,6, валина 12,7, фенилаланина 10,3, лейцииа 15,7. Для солянокислых солей аргинипа, лизина и гистидина при расчете содержания в пих азота принимали поправку. Несоблюдение при составлении «свидетелей» количественного соотношения аминокислот ведет к ухудшению разделения их на бумаге. Разгонка аминокислот. В качестве растворителя используют свежеприготовленную смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в следующих объемных соотношениях 4:1:5Би4:1: 1. После разделения смеси в результате пропускания растворителя бумагу высушивают, а затем снова пропускают растворитель. Такой прием можно повторить 3—6 раз. В результате этого пятпа 58
| | | |
аминокислот приобретают форму полос, вытянутых перпендикулярно направлению движения растворителя. Первый раз растворитель пропускают ua 2/5 листа, затем площадь его действия постепенно увеличивают. При делении смесью 4:1:1 шестикратно получаются отчетливые пятна следующих аминокислот: цистина, аргинина, аспарагиновой кислоты, серила, глицина, глютаминовой кислоты, треонина, аланина. При чередовании растворителей: 4: 1:1 три раза, а затем 4:1:5 три раза четко делятся цистин, лизин, гистидин, аланин, пролин, тирозин, фенилаланин и лейцины. Для разделения метионина, валина, фенилаланина и лейцинов достаточно трехкратного пропускания растворителя 4:1:1. На качество разделения аминокислот влияет виешияя температура. При низкой температуре в хроматографических камерах качество разделеция для некоторых аминокислот (лизии и гистидин) снижается, а при высокой температуре— затрудняется разделение метионина и валина.
Проявление хроматограмм. Перед проявлением хроматограмму пеобходимо тщательно высушить для удаления растворителя. Проявляющий раствор готовят перед употреблением смешиванием 95 частей 0,5% -ного раствора нингидрина в ацетоне, одной части ледяной уксусной кислоты и четырех частей воды. Листы смачивают, погружая их в раствор ниигидрина, высушивают па воздухе и помещают для развития окраски в термостат с температурой 75°С на 15 минут. Проявленные аминокислоты в виде сине-фиолетовых пятен затем переводят в стабильные медные комплексы. Для этого хроматограмму смачивают в растворе азотнокислой меди (1 мл насыщенного водного раствора азотнокислой меди и 0,02 мл 65%-ной азотной кислоты разбавляют 100 мл ацетона). После высушивания на воздухе появляются яркие красно-ораипжевые пятна медного комплекса. Различные аминокислоты дают окраску разной интенсивности. Интенсивность окраски измепяется в зависимости от многих условий, поэтому подсчет аминокислот по стандартным кривым ведет к дополнительным погрешностям. Гораздо точнее идентифицировать аминокислоты с помощью «свидетеля»— смеси аминокислот, которые располагаются в определенной последовательности в соответствии с величиной Rf, характерной 59
для каждой амипокислоты при данном подвижном растворителе.
Элюирование пятен. Из проявленной хроматограммы вырезают пятна, содержащие по одной аминокислоте, измельчают и помещают в пробирки. В каждую наливают no 5 мл 75%-ного этилового спирта и ставят в темноту на один час. Колориметрируют на ФЭК-М при зеленом светофильтре в кювете против контроля (элюат фона).
Плотность каждой аминокислоты гидролизата сравнивают с плотностями их в смеси-«свидетеле», где известно количество каждой аминокислоты. Концентрацию
аминокислот рассчитывают по формуле:
‚ 100ХАХЭ. ХИ, ХУ. XS <9;%laxY, ' где Х — содержание аминокислоты (г% па сырое А —пнавескавещество)свидетеля; (г); В — павеска вещества (г); П, — объем наносимого «свидетеля»; I],Э, —— экстинцияобъем наносимогоданной вещества;аминокислоты в «свидеЭ, — экстинциятеле»; данной, аминокислоты в гидролиУ, — зате;объем разведения «свидетеля»; У, — объем разведения гидролизата. ся наСодержание16 г азота.аминокислот в тканях пересчитываетПри помощи данного метода можно количественно определять свободные аминокислоты белковых гидролизатов крови, мочи, экстрактов из тканей и других биологических жидкостей, содержащих 0,05—0,20 мгМ каждой аминокислоты. Метод применим для всех аминокислот, за исключением пролина и оксипролина, которые образуют с нингидрином соединение красного цвета, при нагревании переходящее в производное желтого цвета. Пятна пролина и оксипролипа проявляют раствором 0,2%-noro изатина в ацетоне. Пятна этих аминокислот после прогревания при 70—75° в атмосфере, насыщеппой парами воды, приобретают голубую окраску.
