‘ В связи с тем что триптофан разрушается при кислотном гидролизе полностью, для ero определения образец гидрелизуют раствором щелочи, а его количество определяют химическим методом (см. стр. 49). f
Свободные аминокислоты
Свободные аминокислоты во многих биологических материалах содержатся в незначительных концентрациях по сравнению с другими компонентами. Поэтому образец частично очищают. Обычио хроматографическому анализу препятствуют белки, липиды, неорганические соли, сахара и мочевина. В зависимости от материала содержание их бывает разным. Кровь. Часто определяют содержание свободных аминокислот в плазме крови. Для получения ee кровь стабилизируют антикоагулянтами: на 20 мл крови добавляют гепарина 100—200 ед., герудина 1%-ного 8 капель, 25%-noro щавелевокислого натрия или калия и 10% -пого натрия лимоннокислого по 0,5 мл. Далее кровь центрифугируют 15 минут при 3000 об/мии, плазму сливают и используют для анализа. Плазму можно’ получить отстаиванием гепаринизированной крови в холодильнике в течение 24 часов с последующим отсасыванием верхнего слоя. Для получения свободных аминокислот плазмы необходимо осадить белок. Существует много способов осаждения белков: 0,04 г раствора уксусной кислоты с последующим кипячением; 3—5%-ным раствором трихлоруксуспой кислоты; этанолом (4—9 частей этанола 96° на одну часть ткани); безводным подкисленным ацетоном; 10%-ным вольфрамовокислым натрием и др. При этом происходит некоторая потеря аминокислот. Выход ux составляет ие больше 85—90% общего а-аминного азота плазмы крови. Несколько больший выход аминокислот отмечен при осаждении белков плазмы 1%-ным раствором пикриновой кислоты (Штейн и Мур, 1954). Вместе с белками пикриповая кислота связывает и липиды, ло сравнению с ацетоном ce обезжиривающее действие полнее. Приготовление 1%-ного раствора пикриновой кислоты несколько затруднепо в связи с плохой растворимостью в холодной воде. Поэтому ее готовят заранее, растворяя в воде с помощью магнитной мешалки. Для осаждения белков в плазме
6!
достаточно B3ATb пятикратный объем 1% -пой пикриновой кислоты, тщательно перемешать полученную эмульсию и отцентрифугировать в течение 10 минут при' 9500 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить и' освободить от пикриновой кислоты, пропуская ее через: колонку с нопообменной смолой Дауэкс 2X8 в хлоридной форме. Длина колонки 30 em, диаметр 2—4 см, толщинадочиойслояжидкостисмолычерез6—8 смолусм. Послепоследнююпропусканияпадо промыть:надоса0,02 н. соляной кислотой по 3 мл пятикратно. Фильтрат выпаривают на водяной бане до объема 1 мл, смывают 10%-ным изопропиловым спиртом до определенного’ объема и фильтруют через бумажный фильтр. Объем окончательного разведения зависит от величипы исходпого образца. В полученном таким образом безбелковом фильтрате можно определить аминокислоты методом бумажной хроматографии. Цельную кровь или изолированные эритроциты сначала подвергают гемолизу, а затем обрабатывают так же,Количественноекак и плазму. определение свободных аминокислот и аминокислот гидролизата одинаковы. В безбелковых фильтратах крови на бумажной хроматограмме можно определить триптофан, который полностью разрушается после кислотного гидролиза, а также орнитин, тауPMH, цитруллин, аминомасляную кислоту, которые не обнаруживаются после гидролиза. Ткань. Получить безбелковый фильтрат из любой ткани можно этим же способом, предварительно приготовив тканевой гомогепат. В процессе автолиза быстро увеличивается количество свободных аминокислот. Поэтомуморозить исследуемый(лучше всегоорганжидкимрекомепдуетсявоздухом) сначалаи депротеи-занизировать еще перел оттаиванием. Впутренние органы дают особенно сильпые пятна таурипа, этаноламипофосфорной кислоты и глютатиона. К наиболее сильтым пятнам небелковой фракции мозга относятся пятна соенинений. биохимически близкие к тлютамиповой кислоте, глютамипу и аминомасляной кислоте. Таким образом. методом одномерной бумажной хроматографии в безбелковых фильтратах различного биологического материала можно количественио определять следуюние аминокислоты: цистин, орнитии, лизин, ти-
стидин, аргинин, цитруллин, глюгатион, аспарагиновую кислоту, серин, таурин, глютамнновую кислоту, треонин, аминомасляпую кислоту, алании, пролин, тирозин, триптофан, метионии, валин, фенилалании, лейцин- изолейцин.
Хроматография на колонках водяную Колопкойрубашкуназываетсяи sa стекляннаяслекляни: труока,6x имеющая Мм м ole у & заполненная тонким нераствори» ев рошком — адсороептом. Применяемые в настояnan В ив колонки для определения пейтральных и кисМ высоту 170 или 70 см, а для 09 см. В качестве Наполи м. Диаметр ок papel ют синтетическу О Коломкй! ODEO приме1.120 CC-120 скую 50 в марок: амберлит Колонск О 150 c <4 и 508, зеокарб-225. Для 56+9мк a J a pow см “spe one имеют в диаметре © более nрубыми ae колонокчастицамиOW дробят,MT смразделяют— 40-47 мк.на Смолуфракаль обрабатывают способами, описываемыми в спеПеред оао aes oe | Ном ма р venus колонки смолу ВЗМУучиваЮл, B ABO” стеклянный фильтр На слой РОДЫ И выливают на фильтровальную магу м о ea mk i ads раствором соляной КИСЛОТЫ Р р мывают и. Я але кислоты, до прозрачного состояния то ИР ° cup м BOXOW до он реакции. ПоАОН oe bye ‚смолу, добавляют три объема 2 и. и а а слабо подогревают в течение часа Ной водой, о ‘ом фильтре промывают дистиллированОколо 100 Mat бота Ta й (rene ona apna м расотаннон таким образом смолы фе en hore ется ara солью) промывают буa cant об ven ср и до рН фильтрата 4,0. Затого же 6 Fens мае с двумя объемами Пижний К уф ра, взоалтывают и заливают в колонку, mui10M. KaКакeltтольккот о ройчастьзакрытсмолырезиновой!осядет плотнымтрузкойслоем,Е зазажим удаляют и колонку продолжают заполнять смо180'c hn ее слой не достигиет 4—5 см сверх отметки Teper заливкой смолы 6 . Ват 019! a. paeTBopom IN ‘OH ольшие колонки ополаски‚2 н. раствором МаОН, а потом буферным раство63
