pom c pH 3,25. Смолу для колонки в 15 см перед заливкой взбалтывают с 0,35 и. раствором буфера с pH 5,28. Образцы перед внесением в колонку разводят буферным раствором с рН 2,2. Применяемые при хроматографии на колонках буферные растворы приведены в таблице 8.
| Буферные и | растворы для колончатой 7 FJ | Таблица в хроматографии В | алый |
|---|---|---|
| РИ буфера . ООО | маль- ность Нор- EE, | |ЖН.О leer SE кислотах (г) | ЕЕ Naon (г) | | nee Hcl (мл) eeeree | | | Sees: Конечный объем (1) eens раствор фенола (ма) | |
| 4,25+0,02 3,25-2001 22401 | 5,280.02 | | | pet 020 | 840 105 : 330 rae : 426 80 0,20 0,35 840 491 330 288 184 136 | 5 р — 40 40 40 40 20 20 |
| бы Буферпые предотвратить | у растворы развитие готовят в них микробов, | заблаговременно, добавляют что- |
| кристаллики | тимола и хранят па холоду. | К буферам, |
| используемым | в высоких колонках, | добавляют 1% тио- |
| дигликеля | и 5 мл на 1 a буфера | 50%-ного раствора |
| препарата | ВКШ — 35. | |
| Работу | на колопках 150 и 50 см | начинают с пропу- |
| скания 150 | мл буфера с pH 3,25 и | подогревапия их до |
| 50° при | помощи микротермостата. Остаток | жидкости над |
| смолой | продавливают азотом. В смолу | не должен попа- |
| дать воздух. наносят на | Образец с 3—5 мг стенку колонки, не дотрагиваясь | гидролизованного белка до смолы, |
| и прохождения смывают Объемы ферного Аминокислоты | ero через буферным колонку раствором 240—280 с буферов раствора устанавливают вводят второй р опытным выходят из колонки в | мл pH первого 2,2. После бу- раствор путем. с р H 495. , такой последо- |
| вательности: глютаминовая | аспарагиновая кислота, пролин, кислота, глицин, | аланин, треонин, цистин, серин, |
| валин, аланин. | метионин, изолейцин, лейцин, Обычпо объем элюата не | тирозин и фенил- превышает 500 мл. |
| При давлении | 15—20 см ртутного столба | за час выте- |
| кает 15—20 | мл элюата. -- | |
| Элюат | собирают в пробирки из оптически | однородного |
| стекла, 64 | калиброванные на Ги 2 мл. В | каждую пробир- |
ку отбирают | или 2 мл элюата. По окончании элюирования в пробирку с элюатом добавляют | мл ниигидрнинового раствора, встряхивают и штатив помещают в кипящую водяную баню па 15 минут. После охлаждения до комнатной температуры в пробирку, где появилось окрашивание, добавляют 5 мл 50%-Horo этилового спирта, встряхивают и колориметрируют. Если пробирки оптически однородны, то можно колориметрировать ирямо в них, не переливая в кюветы прибора. Измеряют амипокислоты с зеленым светофильтром р й при 570 MMK, а пролин и оксипролин с синим свето50%-номуфильтром этанолу.при 440Содержаниеmmx. Приборыаминокислотнастраиваютрассчиты-по вают по калибровочной кривой, для этого растворяют 13,1 мг лейцина в 100 мл бу. Н 3,25 3, Ц л буферного раствора с рН 3,25. добавляютИз этого растворадо 10 млберутбуферногов пробиркираствора1, 2, и3, колоримет-4, 5, 6 мл, рируют. По данным этой колориметрии строят калибровочную кривую. Так как за единицу определения берут лейцин, то в расчет содержания аминокислот вносят поправку, пользуясь даниыми интенсивности окраски их приведенными в таблице 9, у TaGanna 9 Интенсивность окраски аминокислот по сравнению с лейцином ОО О g Е Е xoammncsain | EE |) Awmornesora || 22 |) ие ge ЕЕ | Be 23 28 | gs | 38 О Оо По — ыы ны ...| 0,55 | Цитруллии 1,04 а кислота . | 054 Merona ВИ 102 Голотамин ..| 0,99 Греонин ... |0, золейции. .| 1,00 | Аспарагии 0,95 Cepun ....| 0,95 | Фенилаланин 1,00 | 1-аминомасляПролинГлютаминовая... 0,22' |Ре Лизин. ...|..| 1,10102 | Оксипролинпая кислота | 6,0771,02 в . Oe | a в о Count .. ee ВалиАлании.5.... ‘|097| 097 oa| Tupoaun.. .2 2}‚| 100100 || Амунак (1097| | | | |
Обычно концентрацию аминокислот выражают в микромолях на 100 мл, при переводе в граммы микромоли умножают па молекулярный вес. Амниокислоты с осБН. A, Шманонков 65
новными свойствами определяют па колонке высотой 15 см, буферный раствор используют с РН 5,28, скорость вышевытекания10 смэлюатартутногоравнастолба,25—30температурамл в час, 50°давление С. Коли-не чество образца в два раза меньше, чем при работе на больших колопках. Техника внесения та же. При гидролизе белков часть аминокиелот и амидов разрушается, а их азот переходит в форму аммиака, который выделяется вместе с осповпыми кислотами и дает с ипигидрином окравишавие. Осповные аминокислоты эиопруются в следующем порялкс: лизии, гистидин, аргилии. Аммнак обычно выходит после гисти-
Приготовление реактивов
Нингидриновый реактив. Растворяют в 750 мл мстилнеллозольва 20 г нингидрина и 3 г гидриндантина, добавляют 250 мл буфервиого раствора c pil 5,5. Реактив быстро помешают в сосуд из темного стекла под Ниигидрин ипримспяют химически чистый. Продажный реактив перекристалаизовывают. Для этого 100 г вещества растворяют в 200 мл дистиллированной воды, нагрерают почти до кипения, прибавляют около 5 гактивированного угля и через 19 12 мипут фильтруют. При быстром охлаждении выпалают кристаллы. После промывки их высушивают и в таком виде используют Метилцеллозольв очишаюг добавлением к 500 мл 1-2 г сернокислого закисного экелеза и отгонкой носne 23-часового выпаривапия. Используют фракцию, выделяющуюся нри температуре 116—2126°С. Для приготовления гидриндантина растворяют 80 г нингидрина в двух литрах воды, иагретой до 90°, и добавляю 400 wt 5508 -пого naamnopa аоеорОЩОной kite лоты. Через 30 мипут смесь охлаждают до компатион температуры, выпадают кристаллы гидриндаитниа, которые отфильтровывают, промывают водой и сушат в эксикаторе пад фосфорпым ангидридом. Буферный раствор с pH 5,5 готовят, растворяя в двух литрах воды 1640 г безводного или 2720 г с тремя молекулами кристаллизационной воды (NaCoH 0» + 3H,0) уксуснокислого натрия. Приливают 500 мл ледяной yKсусной кислоты и до 5 л волы fn
