терминирующий трансляцию, поэтому синтезированная молекула фермента неактивна. Последовательность в районе кодона 86 в нормальном гене может распознаваться эндонуклеазой AVAII (рисунок 7).

Вторая точковая мутация, идентифицированная в пределах гена аргининсукцинатсинтазы, локализована в кодоне 175 (ССС→ССТ). Эта мутация не приводит к аминокислотной замене, поскольку оба кодона кодируют пролин, но приводит к появлению сайта рестрикции для фермента DdeI после изменения последовательности CCCAAG в последовательность CCTAAG

Нуклеотидная последовательность – Genbank – F1853494. При мутации гена аргининсукцинатсинтазы идентифицировано две точковые мутации. Одна из них – в кодоне 86 – мутация С→Т, меняющая кодон CGA аргинина на кодон TGA, нонсенс кодон, терминирующий трансляцию, поэтому синтезированная молекула фермента неактивна.

Вторая точковая мутация, идентифицированная в пределах гена аргининсукцинатсинтазы, локализована в кодоне 175 (ССС→ССТ). Эта мутация не приводит к аминокислотной замене, поскольку оба кодона кодируют пролин, но приводит к появлению сайта рестрикции для фермента DdeI после изменения последовательности CCCAAG в последовательность CCTAAG.

Брахиспина (BY – Bovine Brachyspina Syndrome) – синдром короткой спины. Летальное заболевание крупного рогатого скота, обусловленное мутацией в гене FANCI, локализованном на 21 хромосоме.

Процесс разработки идентификации данной мутации включал следующие этапы: поиск летального гаплотипа, секвенирование гаплотипа, поиск ключевого гена и казуальной мутации (рисунок 8).

Вследствие недавней идентификации казуальной мутации имеет высокий уровень встречаемости среди голштинской породы крупного рогатого скота – 7,4-12,0 %.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНОДИАГНОСТИКИ

В качестве биопроб для проведения генодиагностики используется различный биологический материал: ткань, кровь, сперма. В процессе взятия каждую пробу подписывают индивидуальным номером. Составляется акт о взятии проб (приложение).

Общая процедура генодиагностики наследственных мутаций крупного рогатого скота с помощью анализа ПЦР-ПДРФ представлена на рисунке 9.

Выбор метода выделения геномной ДНК определяется в зависимости от исходного материала, а также цели исследования и необходимого времени хранения выделенной ДНК. При проведении экспрессанализа ДНК можно использовать готовые промышленные наборы. Срок хранения таких проб – 3-4 дня. С целью длительного хранения и

использования для ряда анализов, ДНК выделяют фенольным или перхлоратным методами. Наиболее оптимальным является перхлоратный метод, поскольку препарат ДНК выделяется достаточно чистым, пригодным для длительного хранения, а применяемые реагенты менее опасны.

Взятие биопроб (сперма, ткань или кровь)
Выделение и очистка ДНК
Оценка количества и качества ДНК
Амплификация фрагмента гена методом ПЦР
Проведение рестрикционного анализа
Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов
Идентификация аллелей
Выдача результата заказчику

Рисунок 9 – Процедура генодиагностики наследственных мутаций крупного рогатого скота с использованием метода ПЦР-ПДРФ

Количество и качество геномной ДНК оценивается при помощи спектрофотометра.

Детекция результатов амплификации фрагмента гена и последующей рестрикции ПЦР-продукта осуществляется методом гельэлектрофореза с последующей визуализацией на трансиллюминаторе при помощи компьютерной видеосистемы INFINITY или на генетическом анализаторе (Agilent Tecnologies 2200 Tape). Размеры полученных фрагментов определяются относительно маркера молекулярной длины.