МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНОДИАГНОСТИКИ
В качестве биопроб для проведения генодиагностики используется различный биологический материал: ткань, кровь, сперма. В процессе взятия каждую пробу подписывают индивидуальным номером. Составляется акт о взятии проб (приложение).
Общая процедура генодиагностики наследственных мутаций крупного рогатого скота с помощью анализа ПЦР-ПДРФ представлена на рисунке 9.
Выбор метода выделения геномной ДНК определяется в зависимости от исходного материала, а также цели исследования и необходимого времени хранения выделенной ДНК. При проведении экспрессанализа ДНК можно использовать готовые промышленные наборы. Срок хранения таких проб – 3-4 дня. С целью длительного хранения и
использования для ряда анализов, ДНК выделяют фенольным или перхлоратным методами. Наиболее оптимальным является перхлоратный метод, поскольку препарат ДНК выделяется достаточно чистым, пригодным для длительного хранения, а применяемые реагенты менее опасны.
| Взятие биопроб (сперма, ткань или кровь) | |
|---|---|
Взятие биопроб (сперма, ткань или кровь)
Выделение и очистка ДНК
Оценка количества и качества ДНК
Амплификация фрагмента гена методом ПЦР
Проведение рестрикционного анализа
Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов
Идентификация аллелей
Выдача результата заказчику
Рисунок 9 – Процедура генодиагностики наследственных мутаций крупного рогатого скота с использованием метода ПЦР-ПДРФ
Количество и качество геномной ДНК оценивается при помощи спектрофотометра.
Детекция результатов амплификации фрагмента гена и последующей рестрикции ПЦР-продукта осуществляется методом гельэлектрофореза с последующей визуализацией на трансиллюминаторе при помощи компьютерной видеосистемы INFINITY или на генетическом анализаторе (Agilent Tecnologies 2200 Tape). Размеры полученных фрагментов определяются относительно маркера молекулярной длины.
ДИАГНОСТИКА МУТАЦИИ BLAD (ВРОЖДЕННОГО СИНДРОМА ИММУНОДЕФИЦИТА) ГЕНА CD18
BLAD-синдром (дефицит лейкоцитарной адгезии или синдром врожденного иммунодефицита) – генетически детерминированное заболевание с характером наследования по рецессивному типу, приводящее к разрушению иммунной системы животных. Обусловлен точковой мутацией в кодирующей части аутосомного гена CD18, расположенного на первой хромосоме КРС и контролирующего синтез гликопротеина β -интегрина – поверхностного белка мембраны нейтрофилов, играющего ключевую роль в миграции лейкоцитов к очагу воспаления. Повреждение структуры этого белка приводит к множественным дефектам функции лейкоцитов, миграция которых к месту проникновения патогенов оказывается заблокированной, что исключает эти клетки из процесса уничтожения инфекции.
В гомозиготном рецессивном состоянии является летальным: у телят резко снижаются защитные свойства организма, их иммунная система не способна противостоять вирусным и бактериальным инфекциям, что приводит к гибели животных обычно в раннем возрасте (до года). Наиболее часто наблюдаются нарушения респираторной функции и функции желудочно-кишечного тракта. В гетерозиготном состоянии клинических проявлений не выявлено.
Праймеры для амплификации фрагмента гена CD18:
BLAD1: 5′ -TgA gAC CAg gTC Agg CAT TgC gTT CA- 3′ BLAD2: 5′- CCC CCA gCT TCT TgA CgT TgA CgA ggT C -3′
ПЦР-программа: 93 °С – 5 мин; 35 циклов: 93 °С – 1 мин, 60 °С – 1 мин, 72 °С – 1 мин; 72 °С – 5 мин.
Длина амплифицированного фрагмента – 132 п.о.
При расщеплении продуктов амплификации рестриктазой TaqI при 65 °С идентифицируются следующие генотипы:
генотип CD18TL/TL – 71 и 61 п.о. (животные, свободные от мутации) генотип CD18BL/TL – 132, 71 и 61 п.о. (животные-носители мутации) генотип CD18BL/BL – фрагмент 132 п.о. (животные с рецессивным генотипом)
