4.8 ПОИСК, ОЦЕНКАИЗАПРАВКА ЭМБРИОНОВ В ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ПЕРЕСАДКИ 8-8,5- суточные эмбрионы имеют достаточно крупные размеры (от 0,7 до 1,4 мм в диаметре) и хорошо видны в промывной жидкости невооруженным глазом. По внешнему виду они напоминают икринку рыбы или лягушки. Имеют шаровидную форму и полупрозрачны. Обычно 85% зародышей отыскиваются в промывной жидкости и редко (до 15%) - в ополаскивающем растворе. Найденные в ополаскивающем растворе эмбрионы также пригодны для пересадки, но время их пребыванияв этом растворе должно быть максимально сокращено. Поэтому рекомендуем’ осмотр колб с целью поиска зародышей начинать с ополаскивающего раствора, а затем - промывной жидкости. Как в ополаскивающем, так и в промывном растворе зародыши оседают на дно сосуда. В случае затруднения с поиском зародыша раствор в колбе посредством плавных круговых движенийсевшийраскручивают,зародыш причто этомприводитвсплываетк взмучиваниюи, описываяосадка.круги, перемещаетсяруживаемым. Найденныев толще жидкостэмбр и оныи становитсяотсасывают легко обна-из колб посредством длинных стеклянных пипеток и переносят в чашки Петри с раствором ФБС для их оценки под бинокуляром. Для поиска мелких эмбрионов в промывной жидкости можно использовать специальные фильтры (например, ahaр атНЫ‚ оранция?.НЫ ehinitube, п о внешнему виду, при осмотре под микроскопом, эмтенциально жизнеспособные, проблемные или сомнительбрионы могут быть отнесены к одной из трех категории: поные и погибшие. Жизнеспособные эмбрионы имеют правильную форму (шаровидную или слегка эллипсоидную), полупрозрачны, имеют четко выраженную клеточную структуру и хорошо различимый зародышевый узелок (эмбриобласт). Эмбриональная оболочка (капсула) плотно прилегает к клеточной массе и при осмотре не видна (Рис.7). 51
Проблемные или сомнительные эмбрионы также полупрозрачны, шаровидной формы, имеют четкую клеточную структуру. Капсула у них бывает частично или полностью отслоена от клеток трофобласта и хорошо видна при осмотре зародыша под микроскопом (Рис. 8.). В наших опытах были случаи приживления и развития таких эмбрионов в нормальных жеребят-трансплантатов. Однако процент приживляемости зародышей этой категории понижен. Погибшие эмбрионы непрозрачны, матового цвета, внешняя оболочка (капсула) сильно отделена от клеточной массы, клетки сморщены и сжаты в бесформенный комок (Puc.9). Пересадку таких эмбрионов не производят. он стерильнойПосле оценкипипеткой переносятпредназначенный из для пересадки раствора ФБС вэмбри- чашку Петри с пересадочным раствором. В целях удобства работы берут чашку Петри малого диаметра, пересадочный раствор наливают тонким слоем (2-3 мм) и помещают на столик микроскопа с нижней подсветкой. С помощью шприца (1-2 мл), через переходник, среду с зародышем, диаметр которого не превышает 07,-0,8 мм, засасывают в полиэтипеновую 0,5 соломинку (пайету) в следующей последовательности: 1/3 - 1/4 длины пайеты - пересадочная среда, затемс эмбрионом, 5-7 мм - пузырекзатем воздуха,снова пузырекзатем воздуха,1/3 - 1/4 пайетыи оставшееся- среда жидкостьюпространство заполняют средой. При соприкосновении с нец пайеты.клеевая пробка затвердевает, закупоривая коПайету. отсоединяют от переходника и помещают в abl струмент для пересадки открытым концом наружу, а клеевой пробкой - к стилету, навинчивают головку инструмента и на ют полиэтиленовый санитарный чехол. Готовый к пересадке 2/3 его длины вставляют стилет. Поверх инструмента надеваинструмент сохраняют в горизонтальном положении при температуре не ниже 18°С. Особенно тщательно следят за тем, чтобы вставленный на 2/3 длины стилет случайно не был продвинут глубже, что может привести к потере зародыша. ae
Для эмбрионов диаметром > 0,8 мм предусмотрены пересадочные пипетки с внутренним пластиковым катетером (например, фирмы Minitube, Германии), в который эмбрион с помощью шприца всасывается вместе с пересадочной средой в объеме 2 мл (Puc.6). В этом случае нет необходимости заправлять эмбрион в 0,5 мл соломинку перед пересадкой. Внутренний катетер плотно фиксируется в пипетке. При этом шприц остается соединенным с катетером до конца пересадки. При работе с эмбрионами необходимо тщательно следить за температурой растворов и окружающей среды, резкие изменения которой как в одну, так и в другую сторону могут привести к повреждению и гибели трансплантата. Поэтому все манипуляции с зародышами следует проводить в помещении или камере с соблюдением требуемого температурного режима.
-
4.9 ПЕРЕСАДКА ЗАРОДЫША КОБЫЛЕ-РЕЦИПИЕНТУ
-
Пересадку зародыша кобыле-реципиенту выполняют в
-
следующей последовательности: 1. Предварительно, для повышения уровня приживляемо| cm эмбриона ара кобылы команду ся ввести реципиенту миорелаксант (препарат «Ханегиф», Венгрия,седативноевнутримышечносредство. 8-10 мл) и, ' при необходимости,
-
Через 15-20 минут после инъекции кобылу-реципиента заводятвых массв еестанок, прямуюфиксируют, кишку, тщательноосвобождают с мыломOT моюткалонаружные половые органы и прилегающую к ним область, ополаскивают и высушивают бумажным положении. тенцем, бинтуют и фиксируют хвост в верхнем поло-
-
Одетой в одноразовую стерильную полиэтиленовую перчатку рукой берут приготовленный для пересадки инструмент с эмбрионом и сверху на его головную часть и руку надевают защитный полиэтиленовый че-
53
