‚ лежитВ основеразработанныйсовременныхв началехроматографическихХХ века русским методовученым М. С. Цветом метод разделения смеси раствореппых, близких в химическом отношении веществ избиратсльной адсорбцией на столбике адсорбеита. До Цвета считали, что в зеленых частях растеций. содержится только один пигмент хлорофилл. Цвет приготовил водную вытяжку пигмента растений и peшил его отфильтровать «через столбик окиси аммония», помещенного ‘cn в стеклянную трубку или колонку, О ини как показано на рисунке 1. О eavpepure Оказалось, что в результате su) фильтрования пигмент листьев разт делился, по крайней мере, на четыИН ре вещества, распределившихся на ИХ — разных высотах столбика адсорНЫ бента. в После анализа было установБАЦ “проти содержит определенное вещество В лено,Начинаячтосверхукаждаяэтимизонавеществамиокраски i оказались ксантофилл, затем хло— рофилл, В-каротин и оа-каротин. И Они осели на поверхности частиц bi окиси алюминия, но вследствие | `\ разной способности к адсорбции Mes Waa они распределились в разных Me(ey стах колонки. <= Со временем было испытано огPitt! 1. Anéopoivionромное количество адсорбентов, пая оп og разных форм сосудов для адсорбM. С Цвету после ции ит. д. В настоящее время хропрохождения pactroматографический анализ очень ЙА пигмента из лимногих смесей веществ, в том чис oe ле аминокислот, проводят на бумаre (бумажная хроматография) и на колонках (колоичагая хроматография). При этом было выяснено, что хроматография основана на адсорбини (адсорбционная хроматография) и распределении веществ между несмешительнаявающимисяхроматография).растворителямиПо-видимому,пли фазамиочень(распредели-часто оба ; а netic 5 эти принципа действуют одновременно.
4*
51
Поясним сущность этих двух процессов ири помощи схематического изображения (рис. 2). В процессе адсорбции молекулы растворенного вещества концентрируются на открытой поверхности частиц адсорбента. Скорость адсорбции веществ при прохож дении раствора через колонку зависит от адеорбционной их активности. Наиболее активные вещества адсорби руются быстро в верхней части колонки, а менее актив ные — в нижней. Многие вещества растворяются в несмешивающихся растворителях. Например, аминокислоты растворяются
растворителях. Например, аминокислоты растворяются МЛС: Ja СА.a = ввомводеспирте.и в бутило-Если к Я быть, ух раствору аминокисЕ UR: Res 30. лоты в воде доба ge PE № prem a BHTb бутилового НА a ce в спирта, часть молса i ae 4 29 кул аминокислоты жа SE ЗЕ yas: ee перейдет из воды в А ь бутанол. Если одии ИЗ растворителей, рис.адсорбции2. Схемалическое(А) и распределенияизображениемежнапример воду, cAeду жидкими фазами (Б). лать пеподвижным I — нодвнжиая Gaza: лее. (слева) MENON (неподвижная фавижная фаза; п (Справа) ситель — твердый ко за), то ири продви неподвижной жидкой фазы, жении второй фазы растворенное в пей вещество целиком перейдет в неподвижную фазу— Boду и сконцентрируется в определенном месте согласпо закону распределения. (Б)Этотрисункапроцесс2, гдеиллюстрируетсявода, адсорбируясьна правойна поверхностиполовине частиц адсорбента, стала неподвижной фазой, извлекающей молекулы растворенного вещества из проходящей подвижной фазы, TO есть бутанола. На принципе распределения веществ между фазами основала бумажнаястоитХроматографияхроматографияиз волокон клетчаткиаминокислотвеществ, разнойв томна бумаге.числевеличины,аминокислот.Бумагапа кото-сорых могут адсорбироваться молекулы растворенного вещества или растворителя. Вследствие этого бумагу соответствующих сортов стали применять в хроматографическом анализе смесей веществ в растворе, в том числе и аминокислот.
Ч
Ч
При любом методе хроматографии определяют толь‚ ко свободные аминокислоты. В общих чертах схема количественного определения аминокислот в биологических объектах (корма, кровь, мясо, молоко и т. д.) методом хроматографии на бумаге следующая. Ha хроматографическую бумагу, на расстоянии 6—8 см от края, пипеткой паносяг пробу гидролизата, содержащую амивокислот около | мг. Край бумаги, около которого нанеcell гидролизат, погружают в растворитель. Если погружают верхний край бумаги, то растворитель, пропитывая бумагу, будет стекать вниз. Такая хроматография пазывается нисходящей. Ссли же в раствор погружен нижний край бумаги и растворитель будет подниматься по ней вверх, хроматография называется восходящей. В том и другом случае растворитель, продвигаясь по бумаге, растворяет содержащиеся в образце аминокислоты. Они движутся по бумаге с разной скоростью в зависимости от скорости движения растворителя. Отношение скорости движения аминокислоты к скорости движения растворителя величина для каждой аминокислоты постоянная. Это отношение называется постоянной ПОДВИЖНОСТИ И обозначается символом RI. При прохождеиии растворителя по бумаге аминокислоты разделяются в соответствии с их Rf. Поэтому, когда разделение прекратится, растворитель испарится и бумагу смочат нингидрииом, па ней появляются расположенные в ряд, окрашенные в фиолетовый, фиолетово-синий и близкие к UHM цвета пятна, каждое из которых представляет скоплепие окрашенных молекул той или иной аминокислоты. Это и есть хроматограмма ружить,аминокислот.разделить,Хроматографиейа затем и количественнопа бумаге можноопределитьобнадо 18 аминокислот, находящихся одновременно в одном растворе. Степень окраски пятен пропорциональна содержанию в пих аминокислот. Определить содержапие любой амипокислотыпятенменно пробырядомможно,си ней,стапдартнойнлисравииваяфотометрически,смеси,интепсивностьнаносимойсмываяодновре-окраскикаждую аминокислоту с пятна, вырезапиого из хроматограммы. По показателю экстинции фотометра содержание амипокислоты устанавливают при помоши стандартной кривой, изготовлеппой для каждой аминокислоты заранее.
53
