Ч
При любом методе хроматографии определяют толь‚ ко свободные аминокислоты. В общих чертах схема количественного определения аминокислот в биологических объектах (корма, кровь, мясо, молоко и т. д.) методом хроматографии на бумаге следующая. Ha хроматографическую бумагу, на расстоянии 6—8 см от края, пипеткой паносяг пробу гидролизата, содержащую амивокислот около | мг. Край бумаги, около которого нанеcell гидролизат, погружают в растворитель. Если погружают верхний край бумаги, то растворитель, пропитывая бумагу, будет стекать вниз. Такая хроматография пазывается нисходящей. Ссли же в раствор погружен нижний край бумаги и растворитель будет подниматься по ней вверх, хроматография называется восходящей. В том и другом случае растворитель, продвигаясь по бумаге, растворяет содержащиеся в образце аминокислоты. Они движутся по бумаге с разной скоростью в зависимости от скорости движения растворителя. Отношение скорости движения аминокислоты к скорости движения растворителя величина для каждой аминокислоты постоянная. Это отношение называется постоянной ПОДВИЖНОСТИ И обозначается символом RI. При прохождеиии растворителя по бумаге аминокислоты разделяются в соответствии с их Rf. Поэтому, когда разделение прекратится, растворитель испарится и бумагу смочат нингидрииом, па ней появляются расположенные в ряд, окрашенные в фиолетовый, фиолетово-синий и близкие к UHM цвета пятна, каждое из которых представляет скоплепие окрашенных молекул той или иной аминокислоты. Это и есть хроматограмма ружить,аминокислот.разделить,Хроматографиейа затем и количественнопа бумаге можноопределитьобнадо 18 аминокислот, находящихся одновременно в одном растворе. Степень окраски пятен пропорциональна содержанию в пих аминокислот. Определить содержапие любой амипокислотыпятенменно пробырядомможно,си ней,стапдартнойнлисравииваяфотометрически,смеси,интепсивностьнаносимойсмываяодновре-окраскикаждую аминокислоту с пятна, вырезапиого из хроматограммы. По показателю экстинции фотометра содержание амипокислоты устанавливают при помоши стандартной кривой, изготовлеппой для каждой аминокислоты заранее.
53
Часто аминокислоты с близким зиачепием ВТ при первом хроматографировании дают общее пятно. Чтобы разделить такие аминокислоты, тот же растворитель пропускают два и больше раз или же используют другой растворитель. Для разделения аминокислот, образующих общие WITHA ири одпомериом хроматографировании, то есть при пропускапин раствортеля только в одном направлении, применяют двухмериое хроматографирование, то есть в двух перпендикулярных друг другу направлениях. Диля этого бумагу с одпомерной хроматограммой поме-
реке 8 щаютемв лодочкум сарас=e У во eropbitl —=Е^—}pe тому краю, i | % был погружен в рас име hepuom Rpesad@rpatin uy a YE р “I atl ; ровании. Оборудование для гПе" | хроматографии аминоeeamaй 2 ществуеткислот на бумаге.много Cy- BH| ee дов хроматографичеРис, ских камер, одна из 3. Хроматографическая камера: HHX, предназначенная ee камеры его парами Лодовдля нисходящей хрокаToneкой 2 укрепленаeC наОйстоликеион3. Листы Р, Матографии,На рисунке 3. показанаПри Boc4 Фронт нисходящей фазы на бу ходящей хроматограMare обозначен цифрой 6. фии лодочка в камере камеры.жную фазуНа рисункеналивают4 показаныв сосуд, которыйнемикропипеткитребуется,м ставятадляпаподви-днонанесения проб гидролизата на бумагу Точность расчета, а следовательно, и определения аминокислот методом хроматографии па бумаге во миогом зависит от правильного взятия пробы. Концентрация испытываемых веществ должна быть слабой и объем пробы небольшой. Поэтому требуется Touran калибровка микропипеток и аккуратное нанесение образца па бумагу. Обычно удовлетворительпые результаты получают при пользовании пипетками, применяемыми для анализа крови. Для удобства часто микропипетку у
`° делают с микровинтом, при помощи которого капля выдавливается весьма точно. Разгонку аминокислот и об. работку бумаги проводят в вытяжном шкафу. Растворители. При хроматографии аминокислот па бумаге применяются следующие растворители. Фенольный растворитель. Смешивают восемь объемов фенола с тремя объемами дважды дистиллированной оды, Технический фенол предварительно перегоняют при атмосферном давлении с воздушным холодильником.12 млДляводы,этого100в мгперегоннуюалюмиколбу берут 100 г фенола, пиевого порошка и 50 мг двууглекислого натрия. у Смесь фенола с водой нейЕ тральна, в темноте сохра ияется несколько месяцев. Бутилово-уксусньй растворитель. Его применяют *?° свежим, поэтому гото 15 вит Tener ева: Предварительноpea употреблением.бутиловый ® спирт отгоняют, собирая $ фракцию в днапазоне 116 120°С. Ледяная уксусная кислота должна быть хи[4 6 6 2 мически чистой. Раствори- ам oe ; тель готовят из девяти — Hecenng м проб На бума объемов бутилового спира тематологическая; 6 — atuxyoTa, одного объема ледяной пипетка по Линдерстрему-Лангу 1 суксуснойполовинойкислотыобъемови биди-дв ух пробкой;Холтеру:Мейнхарду„®—^г микропипеткамикропинпеткаи Хэллу. вос стиллята. Бензил-третичнобутиловый растворитель состоит из пяти объемов бензилового, пяти объемов третичного спирта и двух объемов бидистиллята. Спирты предварительно очищают перегонкой. Реактивы. Коллидин. Применяют без других компонентов. Продажный препарат перегоняют с добавлением концентрированной соляной кислоты. Отбирают фракцию, перегоняющуюся при 169—170°. Хранят H используют в темноте. Натрий-фосфатный раствор. Готовят 1 М раствор фосфата натрия. Для удаления тяжелых металлов этот
