а раствор встряхивают с насыщенным раствором А в четыреххлористом углероде (25 мл раствора on на | a раствора фосфата натрия). Из этого осповно раствора готовят 0,01 M и 0,04 М ‚растворы. ЗОВ ру фосфатаНатрий-фосфатныйнатрия, приготовленного,буфер, РН 2,5. какК 0,04у Hagaha1 теBu добавляют копцентрированную фосфорную кислоту получения раствора с pH 2,5. . ратНингидрин.пригоден дляВыпускаемыйработы без промышлениостьюочистки. пре Нингидриновые реактивы следующие: a6 Открывающий раствор — 0,05%-ный раствор в аб лютном1. 2%-пыйметаноле.раствор ниитидрина в 95%-пом4 этано, к которому добавлено 2% смеси из ледяпой уксус кислоты и коллидина (5:1). Раствор применяется то ко свежим. из 2.девяти2%-ныйчастейраствор95%-ноговингидринаэтанола ви смеси,одной частисостояк лидин-уксусной кислоты (5:3). ют 3.в 20[ млмгсмесинингидринаметилцеллозольва и 2 мг гидриндантинас натрий-ацетатраство буфером, РН 4,60 (1:1). 4. 4$ -ный раствор нингидрина в смеси, состоя из девяти объемов бутилового спирта, одного объ 6 М фосфорной кислоты. 5. 4% -ный раствор в смеси из девяти объемов бу лового спирта и одного объема | и. фосфорной кис ты. Готовят перед использованием. . лымМетилцеллозольвжелезом. Храняточищаютего приперегонкойкомнатнойнадтемператсернок 1--2 месяца, при температуре минус 20° —- приме полгода. . Буферный раствор с pH 4,6. К молярному| ра уксуснокислого натрия добавляют ледяную уксус кислоту до получения РН 4,6. 7 sour Едкокалиево-боратный буфер. 9,28 г борной и растворяют в 100—150 мл абсолютного метанола. ливают 32,5 мл 6 н. едкого кали и объем смеси дово метанолом до 500 мл. Ледяная уксусная кислота (химически чист 95% -ный этиловый спирт перегоняют из лимонной ‘оты, 56
а А ne от В е une, д ane епа6 бсооле, спой оль,. ящей колорятным . ящей ъема утисло-
кистуре ерно ав сную rs и 11риодят тая), кис-
Предварительно ткани и органы только что убитого животного быстро освобождают от жира и соединительной ткани и растирают в гомогенизаторе. Для гидролиза навеску, содержащую 100—200 мг сырого протеина, помещают в ампулу объемом 50 мл и приливают 20 мл 6 н. соляной кислоты. Ампулу запаивают. В таком виде образцы можно хранить длительное время. Животные статеткани прилучше120°.подвергатьНаиболее дробномуполное выделениегидролизуцистинав термо-и серина наблюдается после б-часового гидролиза, а ли‘ина, гистидина, валина и лейцина — после 20-часового. Для определения всех других аминокислот достаточно гидролизовать образцы 10 часов. Для кормов растительного происхождения наилучшая продолжительность гидролиза составляет 24 часа. После гидролиза образцов из содержимого ампул фильтрованием удаляют гумины, выпариванием в водяной бане освобождаются от соляной кислоты, Cuponoобразный остаток растворяют в 10 мл 10%-ного раствора изопропилового спирта (консервант) и вторично фильтруют через бумажные фильтры. Гидролизаты хранят в холодильнике (4°C) в пенициллиновых флаконах © резиновыми пробками. Техника нанесения образца. Для разгонки аминокислот вырезают полосы бумаги размером 23X60 см. Положение пятен предварительно отмечают карандашом по сисциально изготовленному деревянному трафарету. Пятна располагаются по прямой прерывистой линии по 2 см длиной с расстоянием между ними 3 см. Пробы наносят в верхней части листа на расстоянии 8 см от края наряду со смесями соответствующих аминокислот-«свидетелей». Образец наносят самозаполняющейся MHKpoиниеткой объемом 7—18 мл. На одном листе располагают по три образца с одним «свидетелем». Если аминокислота дает с нингидрином слабое пятно (например, гистидин), нужно наносить на бумагу большее количестпо гидролизата. Однако не следует забывать, что чем больше концентрация аминокислот в пятне, тем хуже иронсходит деление их в процессе хроматографирования. В процессе нанесения аминокислот на бумагу слелуст соблюдать осторожность: нельзя касаться хрома'ографической бумаги руками, так как остаются сле57
ды, реагирующие с пингидрином. Исходное пятно должно быть небольшим, и при количественном определении размер его и объем наносимого раствора должны быть везде абсолютно одинаковыми. Если размеры наносимого пятна на хроматограмме слишком велики, то пятна стапут размытыми и приобретут пеопределенную форму. Места нанесения хорошо подсушивают на воздухе при комнатной температуре, после чего скрепляют по шесть листов вместе стеклянными палочками и помещают в хроматографическую камеру.
Для приготовления искусственной смеси аминокислот-«свидетелей» берут специальные наборы амииокислот, предварительно подсушивают их в эксикаторе. Чтобы повысить точность анализа, количество каждой аминокислоты в «свидетеле» должно приблизительно соответствовать содержанию ее в гидролизате. Поэтому для каждой ткани составляют свой «свидетель». Для этого на ряд листов хроматографической бумаги одновременно наносят несколько проб разных гидролизатов и смесей-‹свидетелей» в различных концентрациях. После этого визуально находят наиболее близкие по концентрации пятна каждой аминокислоты-«свидетеля» и гидролизатов. Таким образом добиваются, чтобы разница в экстинции «свидетеля» и гидролизата была в пределах 10—15%. Так, например, для гидролизатов крови свиней в в 10 мл искусственной смеси содержалось аминокислот (в мг): цистина 3,8, лизина 10,4, гистидина 6,3, аргинина 7,6, аспарагиновой кислоты 10,0, серина 9,6, глицина 8,2, глютаминовой кислоты 10,7, треонина 7,7, аланина 14,0, пролина 11,1, тирозина 6,3, метионина 5,6, валина 12,7, фенилаланина 10,3, лейцииа 15,7. Для солянокислых солей аргинипа, лизина и гистидина при расчете содержания в пих азота принимали поправку. Несоблюдение при составлении «свидетелей» количественного соотношения аминокислот ведет к ухудшению разделения их на бумаге. Разгонка аминокислот. В качестве растворителя используют свежеприготовленную смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в следующих объемных соотношениях 4:1:5Би4:1: 1. После разделения смеси в результате пропускания растворителя бумагу высушивают, а затем снова пропускают растворитель. Такой прием можно повторить 3—6 раз. В результате этого пятпа 58
