| | | |
аминокислот приобретают форму полос, вытянутых перпендикулярно направлению движения растворителя. Первый раз растворитель пропускают ua 2/5 листа, затем площадь его действия постепенно увеличивают. При делении смесью 4:1:1 шестикратно получаются отчетливые пятна следующих аминокислот: цистина, аргинина, аспарагиновой кислоты, серила, глицина, глютаминовой кислоты, треонина, аланина. При чередовании растворителей: 4: 1:1 три раза, а затем 4:1:5 три раза четко делятся цистин, лизин, гистидин, аланин, пролин, тирозин, фенилаланин и лейцины. Для разделения метионина, валина, фенилаланина и лейцинов достаточно трехкратного пропускания растворителя 4:1:1. На качество разделения аминокислот влияет виешияя температура. При низкой температуре в хроматографических камерах качество разделеция для некоторых аминокислот (лизии и гистидин) снижается, а при высокой температуре— затрудняется разделение метионина и валина.
Проявление хроматограмм. Перед проявлением хроматограмму пеобходимо тщательно высушить для удаления растворителя. Проявляющий раствор готовят перед употреблением смешиванием 95 частей 0,5% -ного раствора нингидрина в ацетоне, одной части ледяной уксусной кислоты и четырех частей воды. Листы смачивают, погружая их в раствор ниигидрина, высушивают па воздухе и помещают для развития окраски в термостат с температурой 75°С на 15 минут. Проявленные аминокислоты в виде сине-фиолетовых пятен затем переводят в стабильные медные комплексы. Для этого хроматограмму смачивают в растворе азотнокислой меди (1 мл насыщенного водного раствора азотнокислой меди и 0,02 мл 65%-ной азотной кислоты разбавляют 100 мл ацетона). После высушивания на воздухе появляются яркие красно-ораипжевые пятна медного комплекса. Различные аминокислоты дают окраску разной интенсивности. Интенсивность окраски измепяется в зависимости от многих условий, поэтому подсчет аминокислот по стандартным кривым ведет к дополнительным погрешностям. Гораздо точнее идентифицировать аминокислоты с помощью «свидетеля»— смеси аминокислот, которые располагаются в определенной последовательности в соответствии с величиной Rf, характерной 59
для каждой амипокислоты при данном подвижном растворителе.
Элюирование пятен. Из проявленной хроматограммы вырезают пятна, содержащие по одной аминокислоте, измельчают и помещают в пробирки. В каждую наливают no 5 мл 75%-ного этилового спирта и ставят в темноту на один час. Колориметрируют на ФЭК-М при зеленом светофильтре в кювете против контроля (элюат фона).
Плотность каждой аминокислоты гидролизата сравнивают с плотностями их в смеси-«свидетеле», где известно количество каждой аминокислоты. Концентрацию
аминокислот рассчитывают по формуле:
‚ 100ХАХЭ. ХИ, ХУ. XS <9;%laxY, ' где Х — содержание аминокислоты (г% па сырое А —пнавескавещество)свидетеля; (г); В — павеска вещества (г); П, — объем наносимого «свидетеля»; I],Э, —— экстинцияобъем наносимогоданной вещества;аминокислоты в «свидеЭ, — экстинциятеле»; данной, аминокислоты в гидролиУ, — зате;объем разведения «свидетеля»; У, — объем разведения гидролизата. ся наСодержание16 г азота.аминокислот в тканях пересчитываетПри помощи данного метода можно количественно определять свободные аминокислоты белковых гидролизатов крови, мочи, экстрактов из тканей и других биологических жидкостей, содержащих 0,05—0,20 мгМ каждой аминокислоты. Метод применим для всех аминокислот, за исключением пролина и оксипролина, которые образуют с нингидрином соединение красного цвета, при нагревании переходящее в производное желтого цвета. Пятна пролина и оксипролипа проявляют раствором 0,2%-noro изатина в ацетоне. Пятна этих аминокислот после прогревания при 70—75° в атмосфере, насыщеппой парами воды, приобретают голубую окраску.
‘ В связи с тем что триптофан разрушается при кислотном гидролизе полностью, для ero определения образец гидрелизуют раствором щелочи, а его количество определяют химическим методом (см. стр. 49). f
Свободные аминокислоты
Свободные аминокислоты во многих биологических материалах содержатся в незначительных концентрациях по сравнению с другими компонентами. Поэтому образец частично очищают. Обычио хроматографическому анализу препятствуют белки, липиды, неорганические соли, сахара и мочевина. В зависимости от материала содержание их бывает разным. Кровь. Часто определяют содержание свободных аминокислот в плазме крови. Для получения ee кровь стабилизируют антикоагулянтами: на 20 мл крови добавляют гепарина 100—200 ед., герудина 1%-ного 8 капель, 25%-noro щавелевокислого натрия или калия и 10% -пого натрия лимоннокислого по 0,5 мл. Далее кровь центрифугируют 15 минут при 3000 об/мии, плазму сливают и используют для анализа. Плазму можно’ получить отстаиванием гепаринизированной крови в холодильнике в течение 24 часов с последующим отсасыванием верхнего слоя. Для получения свободных аминокислот плазмы необходимо осадить белок. Существует много способов осаждения белков: 0,04 г раствора уксусной кислоты с последующим кипячением; 3—5%-ным раствором трихлоруксуспой кислоты; этанолом (4—9 частей этанола 96° на одну часть ткани); безводным подкисленным ацетоном; 10%-ным вольфрамовокислым натрием и др. При этом происходит некоторая потеря аминокислот. Выход ux составляет ие больше 85—90% общего а-аминного азота плазмы крови. Несколько больший выход аминокислот отмечен при осаждении белков плазмы 1%-ным раствором пикриновой кислоты (Штейн и Мур, 1954). Вместе с белками пикриповая кислота связывает и липиды, ло сравнению с ацетоном ce обезжиривающее действие полнее. Приготовление 1%-ного раствора пикриновой кислоты несколько затруднепо в связи с плохой растворимостью в холодной воде. Поэтому ее готовят заранее, растворяя в воде с помощью магнитной мешалки. Для осаждения белков в плазме
6!
