достаточно B3ATb пятикратный объем 1% -пой пикриновой кислоты, тщательно перемешать полученную эмульсию и отцентрифугировать в течение 10 минут при' 9500 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить и' освободить от пикриновой кислоты, пропуская ее через: колонку с нопообменной смолой Дауэкс 2X8 в хлоридной форме. Длина колонки 30 em, диаметр 2—4 см, толщинадочиойслояжидкостисмолычерез6—8 смолусм. Послепоследнююпропусканияпадо промыть:надоса0,02 н. соляной кислотой по 3 мл пятикратно. Фильтрат выпаривают на водяной бане до объема 1 мл, смывают 10%-ным изопропиловым спиртом до определенного’ объема и фильтруют через бумажный фильтр. Объем окончательного разведения зависит от величипы исходпого образца. В полученном таким образом безбелковом фильтрате можно определить аминокислоты методом бумажной хроматографии. Цельную кровь или изолированные эритроциты сначала подвергают гемолизу, а затем обрабатывают так же,Количественноекак и плазму. определение свободных аминокислот и аминокислот гидролизата одинаковы. В безбелковых фильтратах крови на бумажной хроматограмме можно определить триптофан, который полностью разрушается после кислотного гидролиза, а также орнитин, тауPMH, цитруллин, аминомасляную кислоту, которые не обнаруживаются после гидролиза. Ткань. Получить безбелковый фильтрат из любой ткани можно этим же способом, предварительно приготовив тканевой гомогепат. В процессе автолиза быстро увеличивается количество свободных аминокислот. Поэтомуморозить исследуемый(лучше всегоорганжидкимрекомепдуетсявоздухом) сначалаи депротеи-занизировать еще перел оттаиванием. Впутренние органы дают особенно сильпые пятна таурипа, этаноламипофосфорной кислоты и глютатиона. К наиболее сильтым пятнам небелковой фракции мозга относятся пятна соенинений. биохимически близкие к тлютамиповой кислоте, глютамипу и аминомасляной кислоте. Таким образом. методом одномерной бумажной хроматографии в безбелковых фильтратах различного биологического материала можно количественио определять следуюние аминокислоты: цистин, орнитии, лизин, ти-
стидин, аргинин, цитруллин, глюгатион, аспарагиновую кислоту, серин, таурин, глютамнновую кислоту, треонин, аминомасляпую кислоту, алании, пролин, тирозин, триптофан, метионии, валин, фенилалании, лейцин- изолейцин.
Хроматография на колонках водяную Колопкойрубашкуназываетсяи sa стекляннаяслекляни: труока,6x имеющая Мм м ole у & заполненная тонким нераствори» ев рошком — адсороептом. Применяемые в настояnan В ив колонки для определения пейтральных и кисМ высоту 170 или 70 см, а для 09 см. В качестве Наполи м. Диаметр ок papel ют синтетическу О Коломкй! ODEO приме1.120 CC-120 скую 50 в марок: амберлит Колонск О 150 c <4 и 508, зеокарб-225. Для 56+9мк a J a pow см “spe one имеют в диаметре © более nрубыми ae колонокчастицамиOW дробят,MT смразделяют— 40-47 мк.на Смолуфракаль обрабатывают способами, описываемыми в спеПеред оао aes oe | Ном ма р venus колонки смолу ВЗМУучиваЮл, B ABO” стеклянный фильтр На слой РОДЫ И выливают на фильтровальную магу м о ea mk i ads раствором соляной КИСЛОТЫ Р р мывают и. Я але кислоты, до прозрачного состояния то ИР ° cup м BOXOW до он реакции. ПоАОН oe bye ‚смолу, добавляют три объема 2 и. и а а слабо подогревают в течение часа Ной водой, о ‘ом фильтре промывают дистиллированОколо 100 Mat бота Ta й (rene ona apna м расотаннон таким образом смолы фе en hore ется ara солью) промывают буa cant об ven ср и до рН фильтрата 4,0. Затого же 6 Fens мае с двумя объемами Пижний К уф ра, взоалтывают и заливают в колонку, mui10M. KaКакeltтольккот о ройчастьзакрытсмолырезиновой!осядет плотнымтрузкойслоем,Е зазажим удаляют и колонку продолжают заполнять смо180'c hn ее слой не достигиет 4—5 см сверх отметки Teper заливкой смолы 6 . Ват 019! a. paeTBopom IN ‘OH ольшие колонки ополаски‚2 н. раствором МаОН, а потом буферным раство63
pom c pH 3,25. Смолу для колонки в 15 см перед заливкой взбалтывают с 0,35 и. раствором буфера с pH 5,28. Образцы перед внесением в колонку разводят буферным раствором с рН 2,2. Применяемые при хроматографии на колонках буферные растворы приведены в таблице 8.
| Буферные и | растворы для колончатой 7 FJ | Таблица в хроматографии В | алый |
|---|---|---|
| РИ буфера . ООО | маль- ность Нор- EE, | |ЖН.О leer SE кислотах (г) | ЕЕ Naon (г) | | nee Hcl (мл) eeeree | | | Sees: Конечный объем (1) eens раствор фенола (ма) | |
| 4,25+0,02 3,25-2001 22401 | 5,280.02 | | | pet 020 | 840 105 : 330 rae : 426 80 0,20 0,35 840 491 330 288 184 136 | 5 р — 40 40 40 40 20 20 |
| бы Буферпые предотвратить | у растворы развитие готовят в них микробов, | заблаговременно, добавляют что- |
| кристаллики | тимола и хранят па холоду. | К буферам, |
| используемым | в высоких колонках, | добавляют 1% тио- |
| дигликеля | и 5 мл на 1 a буфера | 50%-ного раствора |
| препарата | ВКШ — 35. | |
| Работу | на колопках 150 и 50 см | начинают с пропу- |
| скания 150 | мл буфера с pH 3,25 и | подогревапия их до |
| 50° при | помощи микротермостата. Остаток | жидкости над |
| смолой | продавливают азотом. В смолу | не должен попа- |
| дать воздух. наносят на | Образец с 3—5 мг стенку колонки, не дотрагиваясь | гидролизованного белка до смолы, |
| и прохождения смывают Объемы ферного Аминокислоты | ero через буферным колонку раствором 240—280 с буферов раствора устанавливают вводят второй р опытным выходят из колонки в | мл pH первого 2,2. После бу- раствор путем. с р H 495. , такой последо- |
| вательности: глютаминовая | аспарагиновая кислота, пролин, кислота, глицин, | аланин, треонин, цистин, серин, |
| валин, аланин. | метионин, изолейцин, лейцин, Обычпо объем элюата не | тирозин и фенил- превышает 500 мл. |
| При давлении | 15—20 см ртутного столба | за час выте- |
| кает 15—20 | мл элюата. -- | |
| Элюат | собирают в пробирки из оптически | однородного |
| стекла, 64 | калиброванные на Ги 2 мл. В | каждую пробир- |
