4 МЕЖМИКРОСАТЕЛЛИТНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ (ISSR-МАРКЕРЫ) У ОВЕЦ РОМАНОВСКОЙ ПОРОДЫ УГЛИЧСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ
В настоящее время в различных областях молекулярной и популяционной генетики, биотехнологии и филогенетических исследованиях широко применяется ДНК маркирование, основанное на полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, множественно локализованных в геноме. Использование данного метода позволяет дифференцировать породы сельскохозяйственных животных, определить межвидовой и внутривидовой полиморфизм, а также оценить генетическое разнообразие в популяции.
Полилокусные спектры фрагментов ДНК, фланкированные инвертированным повтором микросателлитного локуса (ISSR – Inter-simplesequence-repeats маркеры), выявленные при помощи полимеразной цепной реакции с использованием в качестве маркера микросателлитной последовательности являются одним из наиболее удобных способов анализа полиморфизма одновременно большого количества локусов в геноме (Моисеева И.Г. и др., 2006; Глазко В.И. и др., 2013).
Метод ISSR обладает рядом неоспоримых преимуществ, каких как экспрессивный и сравнительно дешевый анализ генофонда без использования данных о нуклеотидной последовательности генома. Имеет кодоминантный тип наследования по менделевскому типу. Данный анализ дает возможность изучить большое количество микросателлитных локусов, расположенных в непосредственной близости от генов или локализованных в них, тем самым способствуя быстрой оценке уровня полиморфизма генома в целом, влияющего на морфологические признаки животных и растений. Благодаря большой длине праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома и точной температуре плавления высоко воспроизводит спектр фрагментов.
Праймеры, использующиеся для получения ISSR-маркеров, состоят из короткого мотива, который комплементарен микросателлитному повтору (4-12 единиц повтора), и от одного до четырех, так называемых, «якорных» нуклеотидов, расположенных на 5' и 3' концах. Таким образом, определяется место отжига праймеров. При подборе праймеров не требуется информация о нуклеотидной последовательности ДНК ( Godwin I.D. et all, 1997; A bbot P., 2001).
Затем, при помощи электрофоретического разделения в агарозном или полиакриламидном геле можно идентифицировать от 10 до 60 полос (ISSRфингерпринтинг). Однако, в процессе реакции амплификации ряд фрагментов
не детектируется. Это связано со слишком большой длиной ампликонов (больше 2,5-3 кб.) ( Zietkiewicz E. et all, 1994; Vijayan Kunjupillai, 2005).
Данный метод оценки генетических связей широко используется для изучения генофондов, определения видов животных и растений, популяций, породных линий, а, в некоторых случаях, индивидуального генотипирования благодаря своей относительно высокой точности и воспроизводимости (Столповский Ю.А. и др., 2010; Pradeep Reddy M. et all, 2002). Определение различий в межвидовых, межпородных, а также внутрипородных генофондах при помощи ISSR-PCR маркеров используется также и в овцеводстве. В настоящий момент происходит вытеснение локальных пород овец под воздействием различных объективных и субъективных причин. Их место занимают более распространенные породы, что приводит потере внутрипородного генетического разнообразия. Для успешного сохранения генетических ресурсов наиболее эффективным являются методы ДНКмаркирования, в частности Inter Simple Sequence Repeats (ISSR-PCR).
По данным Макаровой Н.Н. (2013) и Nesteruk L.V. (2016), сравнивающих генофонды девяти различных пород овец с использованием ISSR-анализа, показано, что романовская порода имеет азиатское происхождение, либо завезена на территорию Тывы, так как образует единую ветвь с тувинской овцой, а также с группой, включающей калмыцкую породу и породу буубэй.
Дальнейшие исследования Нестерук Л.В. (2015, 2016) п оказали, что из 43 фрагментов ДНК у романовской породы овец, подавляющее большинство из них являются полиморфными. Также, в данной работе впервые использован коэффициент генетической оригинальности, в соответствии с которым выборка делилась на пять классов. В зависимости от частоты встречаемости фрагментов были выявлены оригинальные (редкие) генофонды и генофонды, имеющие типичную структуру. Благодаря коэффициенту генетической оригинальности появляется возможность повысить уровень селекционно-племенной работы коренных пород овец.
Анализ связи между хозяйственно-полезными признаками и маркерами доминантного типа наследования у романовской породы овец показал влияние генетической структуры на морфологические и физиологические признаки, а именно, живая масса, настриг шерсти, густота шерсти, средняя плодовитость и другие признаки. На основе ISSR-анализа можно выделить группы особей, отличные по генетическим показателям и имеющие уникальные комбинации аллелей генов, ответственных за количественные признаки (QTL) и оценить взаимосвязь совокупности этих генов и признаков продуктивности. Поэтому такой тип анализа имеет важное значение для оценки хозяйственно-полезных признаков. Редкие аллели являются основой для пополнения банка
генетического разнообразия и уменьшения инбредной депрессии (Нестерук Л.В., 2016).
В связи с относительно широкой изученностью данного вопроса остается актуальным исследование генетической структуры отдельных популяций овец романовской породы, выявление отдельных линий и редких аллелей и формирование на основе полученной информации практических рекомендаций по поддержанию внутрипопуляционного разнообразия и богатства генофонда.
4.1 Характеристика спектров AG- и GA-ISSR фрагментов
При использовании двух олигонуклеотидов (AG)9C и (GA)9C (ISSRпраймеры), комплементарных к микросателлитным локусам (TC)n, (GT)n соответственно, определены специфические спектры фрагментов ДНК в диапазоне от 2500 до 220 п.н.
На рисунке 9 представлена амплификация геномной ДНК с праймером (AG)9C, где видны продукты, которые впоследствии разделены с помощью гель-электрофореза на агарозном геле (2%) в поле электрического тока 120 В в течении 80 минут. В результате получены спектры фрагментов, размеры которых определяли по линейной функции.
На спектрах видны несколько полос (фрагментов) присутствующие у большинства животных и фрагменты, встречающиеся только у отдельных особей. Полученные фрагменты были разделены по 38 размерным группам,
