Использование простагландинов для направленной регуляции и коррекции нарушений функции размножения крупного рогатого скота

ГЛАВА VI. ПРОСТАГЛАНДИНЫ И ИХ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

ГЛАВА VI. ПРОСТАГЛАНДИНЫ И ИХ РОЛЬ В ОРГАНИЗМЕ

Простагландины были открыты в 1930 году [32] в результате обнаружения свойства семенной жидкости человека расслаблять или сокращать миометрий в зависимости, от стадии полового цикла и названы так в результате предположения, что местом их образования является простата.

Затем было уточнено и доказано, что местом образования простагландина, содержащегося в сперме, является пузырьковидная железа. В 1937 году простагландины впервые выделили из семенной жидкости в чистом виде и установили их структуру [14; 15; 16].

После химического синтеза в 1966 году и выяснения физиологической роли - вызывать лютеолизис, началось углубленное и интенсивное изучение механизма их действия и возможностей применения в биологии.

Оказалось, что простагландины синтезируются в клеточных мембранах почти всех органов и тканей в моменты физиологической потребности и имеют очень короткий период полураспада.

По химической структуре это ненасыщенные жирные карбоновые кислоты с 20 атомами углерода, в основе которых лежит протопоидная кислота с циклопентановым ядром и двумя боковыми цепями.

В настоящее время из различных тканей организма человека и животных выделены 14 соединений, относящихся к простагландинам, объединённым в 6 классов и, согласно интернациональной номенклатуре, обозначаемых буквами латинского алфавита. Наиболее распространёнными» являются А, В; Е, Б, которые различают по строению циклопентанового ядра.

Классы, в свою очередь, различают по числу связей в боковых цепях и обозначают цифрами - 1, 2, 3, а по конфигурации 9-й гидроксильной группы – α и β изомеры.

Физиологическое действие простагландинов определяется их высокой активностью, структурными различиями и большой распространенностью в организме. Считают, что простагландины влияют на ткани и клетки непосредственно.

Важную роль играют простагландины в функциях эндокринных желез, что подтверждается их наличием в щитовидной железе, тимусе, надпочечниках, половых железах и др.

Простагландины стимулируют синтез соматотропина, пролактина, прогестерона, окситоцина, тироксина, кортикостероидов, уменьшают инкрецию лютропина и адреналина.

Простагландины участвуют в передаче нервных импульсов, оказывают влияние на деятельность сердца и тонус кровеносных сосудов.

Они стимулируют сокращения миокарда, суживают сосуды и влияют на кровяное давление.

Простагландины группы F (ПГF) увеличивают, а E (ПГЕ) уменьшают сократительную деятельность матки. Простагландины групп F и E регулируют акт родов.

Простагландины, образуемые в эндометрии, стимулируют рассасывание желтых тел в яичниках (лютеолиз) и уменьшают содержание прогестерона в крови.

Они участвуют в регуляции обмена воды и электролитов, влияют на их прохождение через эпителиальные мембраны клеток. Простагландины тесно взаимодействуют с гормонами в регуляции роста и дифференцировки тканей.

У самцов простагландины повышают синтез лютропина и тестостерона, в связи, с чем увеличивается объем эякулята и содержание в нем спермиев.

В половых путях самок простагландины способствуют продвижению спермиев.

В животноводстве и ветеринарии весьма перспективно применение синтетических аналогов простагландинов для синхронизации половых циклов, стимуляции родов и в лечебных целях при некоторых заболеваниях.

В настоящее время имеются десятки препаратов простагландинов и их аналогов с различными фирменными наименованиями – клопростенол, эстрофан, эструмат, лютализ, панацелян, илирен, динопрост, эквимат, простианол и другие, которые выгодно отличаются от естественных простагландинов более высокой активностью и малым побочным действием.

Механизм их воздействия на клетку заключается в изменении секреции циклического аденозинмонофосфата на уровне мембран с одновременным освобождением кальция из клеточных мембран и поступлением натрия внутрь клетки.

Предшественники простагландинов в биосинтезе – арахидоновая, декосатетранолатова, декосапентоэнолатовая жирные кислоты.

Главный этап в синтезе простагландинов – высвобождение свободных кислот из связанного состояния, из фосфоглицеридов и эфиров холестерина под действием фосфолипаз и ацилгидролаз. Продолжительность существования вновь образованных молекул небольшая.

Продукты обмена простагландинов выделяются из организма в основном с калом и мочой.

В последние годы установлено, что во многих клетках организма часть простагландинов с помощью эндопероксидаз превращается в более активные клеточные вещества – тромбоксаны, которые впервые были обнаружены в тромбоцитах.

Считают, что тромбоксаны – это простогландины второго поколения, которые в 50 – 200 раз активнее, чем ПГЕ-2.

Они оказывают сильное действие на гладкую мускулатуру, тромбоциты, жировые клетки и др.

Однако простагландины и тромбоксаны пока используются в основном в экспериментальных условиях.

В настоящее время их производство и практическое применение обходится слишком дорого.

6.1. Синхронизация охоты и овуляция при помощи простагландинов

В настоящее время простагландины широко используются в животноводстве. Основные направления использования простагландинов следующие:

а) использование лютеолитического действия простагландина F_2α для синхронизации охоты и овуляции;

б) использование родостимулирующего действия простагландина F_2α для синхронизации родов;

в) использование сокращающего действия на гладкую мускулатуру для лечения эндометритов.

Новым средством воздействия на функцию яичников явились простагландины.

Однократная или двукратная инъекция ПГF_2α вызывает быстрый бескровный лизис желтого тела, а снижение концентрации прогестерона в крови в конце цикла является пусковым механизмом для секреции ЛГ, начала эстральной фазы и овуляции.

Простагландины были обнаружены в плазме крови маточной вены у коров, концентрация их увеличивается к 16-17-му дню цикла, что совпадает с началом регрессии желтого тела и снижением концентрации прогестерона в крови [171; 146; 185].

В яичниках обнаружен комплекс ПГ-синтетаз, при инкубировании срезов яичника с арахидоновой кислотой синтез ПГF увеличивался.

В конце полового цикла увеличивается выделение основного метаболита ПГF15-кето, 13,14-дегидро-ПГF_2α [255], что указывает на большую роль прогестерона в регулировании выделения ПГF_2α.

Лютеолизирующее действие ПГF_2α проявляется лишь в период высокой активности желтого тела, у коров и телок – на 5-16-й дни цикла. Введение ПГF_2α в этот период вызывает через 1-4 дня охоту и полноценную овуляцию [273; 279].

В конце полового цикла происходит снижение содержания прогестерона в крови, что является пусковым механизмом для секреции маточного простагландина F_2α.

Ряд учёных считает, что лютеолиз происходит за счёт снижения местного кровообращения вызванного простагландином.

При введении простагландина F_2α в дозе 2 мкг/кг крысам внутривенно происходило снижение артериального давления на 10,2%, в дозе 5 мкг/кг – на 19,8% [92].

Снижение давления происходило сразу же после введения простагландина F_2α и в среднем, длилось 40-50 сек.

При введении простагландина F_2α в дозе 10 мкг/кг наблюдался двухфазный эффект – первоначально происходило снижение артериального давления на 20,6%, а затем повышение его на 12,1%.

В результате перфузии среды с добавлением простагландина F_2α через яичники человека наблюдался сосудосуживающий эффект [365].

Также известно, что простагландины оказывают влияние на вазоконстрикторы яичниковой артерии сообшают E.B. Дьяконов [и др.], [19].

Затем лютеальные клетки расплавляются протеолитическими ферментами лейкоцитов и рассасываются.

При экзогенном введении простагландинов происходит процесс снижения концентрации прогестерона и увеличение концентрации гонадотропных гормонов (ФСГ, ЛГ, пролактина, АКТГ) в крови.

У телок инъекция ПГF_2α снижает уровень прогестерона в крови через 24 часа после инъекции с 5,74 нг/мл до 0,80 нг/мл, через 48 часов до 0,30 нг/мл, а через 72 часа до 0,06 нг/мл [262].

Аналогичные данные получены в других опытах [268; 222; 169].

Проанализировав вышесказанное можно сделать следующие выводы: лютеолиз происходит в результате воздействия простагландинов на кровоток направленный к яичнику; после поступления лютеолитических веществ в яичник из-за изменений после образования стероидных гормонов; при изменении секреции гипофизом гонадотропных гормонов.

Поскольку ПГF_2α в период слабого развития желтого тела (через 1-4 дня после овуляции и в период его угасания, начиная с 16-17-го дня) неэффективен, то для действия этого препарата решающее значение имеют сроки введения.

Tanabe T.V., Hann R.C. [356] показали, что инъекция 25 мг ПГF_2α на 7-й, 11-й или 15-й день цикла вызывает дегенерацию желтого тела и синхронную охоту у 86,9%, 90,0% и 98,0%телок соответственно.

По данным Luis T.M. [et al.], [277] эстральные реакции у телок начинаются через 74±3 часа после инъекции ПГF_2α, интервал между началом эструса и овуляцией составляет 24 часа примерно, как и у контрольных телок (29 часов).

Шихов И.Я. [и др.], [116] сообщают, что после внутримышечной инъекции 250 мг эстрофана пришло в охоту 88,5% овец.

После внутримышечной инъекции ПГF_2α коровам со зрелыми желтыми телами, приход в синхронную охоту составляет 80-100% [84; 258].

В опытах E. Kudlac с соавторами [309] оплодотворяемость коров и телок, осемененных в индуцированную охоту инъекцией ПГF_2α, составило 54,9% и 64,8% соответственно.

После внутримышечной инъекции аналога ПГF_2α клопростенола в течение 2-5 дней пришло в охоту 73% коров и телок, осеменение по группе проведено на 11-13 раньше, чем в контроле [336].

По данным Ю.Л. Максимау и Р.Ф. Мядзведзеу [57] после инъекции ПГF_2α оплодотворяется 34-43% коров и 36-62% телок, оплодотворяемость не зависела от возраста животных и продолжительности периода от отела до применения препарата.

Reichel F. с соавторами [368] сообщают о результатах применения препарата эстрофана «СПОФА» в странах СЭВ.

При применении эстрофана с целью синхронизации охоты телок в ГДР оплодотворяемость после 1-го осеменения составила 71-73%, после 2-го – 94-97%, а по отдельным группам – 36,5-59,9%.

В опытах, проведенных в СССР, после инъекции эстрофана оплодотворилось 63,3% коров и 68,7% телок.

По данным Н.Г. Коновалова [50] оплодотворяемость телок, осемененных в индуцированную инъекцией простина, эстрофана или динопроста охоту составила 64,0%, 63,8% и 63,6% соответственно, телок, осемененных в спонтанный эструс – 59,0%.

Применение ПГF_2α в первые дни после эструса не эффективно, и для вызывания лютеолиза, тех животных, которые не реагировали на первую инъекцию, препарат следует ввести повторно через 1-12 дней. К повторной инъекции у коров, имевших в период первой инъекции недостаточно развитые или дегенерированные желтые тела, за этот срок произойдет естественная овуляция, и желтое тело достигнет функциональной зрелости.

Упрощается и обработка животных, так как инъекции можно проводить без предварительного ректального обследования. Методика испытана во многих опытах.

После двукратной инъекции с интервалом в 11 дней в охоту приходит 60-100% животных, при оплодотворяемости 34-80% [357; 330; 322; 247; 241; 235].

По данным многих исследователей, наибольший приход в охоту наступает через 72-96 часов после инъекции ПГF_2α и поэтому широко испытывается применение ПГF_2α для осеменения без выборки в охоте, с однократным осеменением через 60-72 часа после инъекции, или двукратным, через 72 и 90 часов [82].

Возможен и другой вариант: сначала инъецируют ПГF_2α телкам, имеющим желтые тела, а затем, через 11 дней, остальным, без их обследования.

По данным O. Rob с соавторами [322] через 48 часов после инъекции эстрофана течка наступила у 36% коров, через 72 часа у 40%, у остальных позже.

В опытах на 2230 коровах и телках черно-пестрой и активанской породы, Г.Ф. Медведев [60] показал, что при двукратном введении ПГF_2αи осеменении через 72-76 часов после второй инъекции, оплодотворяемость у телок составила 17-62%, у коров 23-50%.

В опыте Yucof N. с соавторами [375] коровам однократно инъецировали ПГF_2αи двукратно осеменяли, оплодотворяемость составила 39,3%. После однократной инъекции ПГF_2α и однократного осеменения в выявленную охоту оплодотворяемость 50,0%.

После двукратной обработки с интервалом 11 дней и однократного осеменения 80 часов после 2-ой инъекции, оплодотворилось 38,5% животных.

Авторы подчеркивают, что оплодотворяемость коров после осеменения в выявленную охоту значительно выше.

В опытах на 326 телках черно-пестрой породы в возрасте 17-20 месяцев Б.Н. Ермолов [и др.], [83] показали, что после двукратной инъекции препарата смеси изомеров ПГF_2α и ПГF_2β с интервалом 11 дней пришли в охоту 90-100% и оплодотворились 52,9-76,0% животных.

Macmillan K.L. [279] синхронизировал половой цикл инъекцией ПГF_2α на 7-й или 16-й день цикла.

В течение 3 дней пришло в охоту 70,1 и 79% коров соответственно, при оплодотворяемости 68%, в контрольной группе – 59%.

Автор отмечает, что двукратная инъекция ПГF_2α с интервалом 11 дней и использование точных методов выявления охоты позволили повысить оплодотворяемость от первого осеменения на 9%. Аналогичные результаты были получены G.J. King с соавторами [256].

После двукратной внутримышечной инъекции ПГF_2α и осеменении через 72 и 96 часов после 2-ой инъекции, оплодотворилось от осеменения за первый цикл и за 2 цикла коров 73,3 и 89,5% соответственно и телок 57,9 и 64,8% соответственно [361].

Результаты по оплодотворяемости от осеменения без выявления охоты при двукратной инъекции ПГF_2α могут сильно различаться.

Так R.I. Waters, R. Ball [371] обработали простагландином F_2α более тысяч коров.

После двукратной инъекции с интервалом в 11 дней коров осеменяли однократно, через 72-86 часов, или двукратно, через 72 и 96 часов.

После осеменения в фиксированное время отелились 40% коров, а при предварительной выборке коров в охоте – 51,4% (в контроле – 48%). После осеменения без выборки в охоте отелилось 40,1% подсосных коров, при выявлении охоты – 46,8%, (в контроле – 46,2%).

Многие исследователи успешно использовали ПГF_2α для стимуляции охоты у телок и коров с так называемой «тихой охотой», которая характеризуется нерегулярностью проявления экструса

Так, Johnson A.R. [246] указывают, что однократная инъекция эструмата и лютализа коровам, не пришедшим в охоту, в охоту в течение 45-50 дней, синхронизировала эструс у 42,3% и 61,5% соответственно, при оплодотворяемости 29,2 и 54,2%.

Plunkett S.S. с соавторами [307] инъецировали ПГF_2α 308 коровам, не приходившим в охоту более 40 дней, пришли в охоту 91% коров, оплодотворяемость составила 44% (в группе нормально циклирующих коров – 52%).

Двукратная инъекция эстрофана телкам, не проявившим признаков эструса в течение 45-60 дней при наличии активных желтых тел и фолликулов, синхронизировала охоту у 80%, при оплодотворяемости 62,2-69,4% (в контрольной группе – 66,4%) [124].

Простагландины применяют также при гипофункции яичников, при фолликулярных и лютеиновых кистах, при эндометритах и при задержании последа.

Кисты могут образовываться вследствие недостаточного выделения ЛГ [55; 253], что нарушает развитие фолликулов, ускоряет их атрезию, приводит к дегенерации уже образовавшихся желтых тел. Введение ПГF_2α в этом случае создает условия для полноценного возбуждения полового цикла.

Ziari M. с соавторами [377] сообшают, что причина образования овариальных кист – это недостаточность синтеза простагландинов, что также задерживает регрессию желтого тела и замедляет смену фаз овариального цикла.

Черемисинов Г.А. и Карымов В.Н. [123] инъецировали коровам с овариальными кистами эстрофан в сочетании с гравогормоном, при этом рассасывание лютеиновых кист за 4-6 дней, а через 23,8 дня наступает оплодотворение.

В опытах Е.Ф. Дьяконова и Н.Н. Щеглова [33] однократная инъекция эструмата или эстрофана коровам с персистентными желтыми телами синхронизировала охоту у 80% и 45,5% коров соответственно, из них оплодотворилось 32,5%. Однократная инъекция ПГF_2α 23 коровам с персистентными желтыми телами синхронизировала охоту в течение 3 дней у 39% из них, при оплодотворяемости 50% [13].

Применение ПГF_2α оказалось эффективным при терапии воспалительных процессов в матке коров [362; 212].

В опыте на коровах с гнойно-катаральным воспалением матки, сразу после обнаружения болезни, им инъецировали ПГF_2α или лечили антибактериальными препаратами.

Применение ПГF_2α было более эффективно, чем применение антибиотиков, и обеспечило оплодотворяемость 63,9-90,0% [67].

Инъекция ПГF_2α 244 коровам с эндометритом способствовала восстановлению репродуктивной функции у 64,75 из них в течение 33 дней после инъекции [368].

ПГF_2α, усиливая сокращения матки, способствует выделению из нее гнойных масс.

Для обеспечения одновременности созревания фолликулов при вызывании суперовуляции для трансплантации зародышей применяют простагландины в сочетании с гонадотропинами [19; 304].

Для повышения эффективности применения ПГF_2α при синхронизировании охоты с применением гестагенов [234] и эстрадиола [167], СЖК [20].

Однако дополните6льное использование этих гормонов не увеличило синхронность овуляции.

Продолжение · 10

Свойство ПГF_2α вызывать интенсивные сокращения матки используется для вызывания родов, что важно для синхронизирования отелов, формирования молочных групп. Эффективны инъекции ПГF_2α и при вялых родах, для улучшения отделения последа, для прерывания беременности по ветеринарным показателям [271; 224; 54; 173].

Роды наступают через 30-70 часов после инъекции ПГF_2α [245].

Murray R.D. с соавторами [231] сообщают, что инъекция клопростенола коровам в последние три недели стельности вызывает роды в течение 48 часов, телята рождаются нормальными, жизнеспособными.

Однократная инъекция клопростенола 64 коровам вызывала роды через 47 часов у 95% коров, однако, в 37% случаев требовалась акушерская помощь, 91% телят родились живыми, у 62% коров отмечено задержание последа [244]. Инъекции клопростенола не влияли на продуктивность коров, здоровье и массу телят. Простагландины применяют также для повышения оплодотворяющей способности семени.

По данным Р.Э. Садыкова [и др.], [42] добавление ПГF_2α в семя перед замораживанием повышает его оплодотворяющую способность на 16,1-31,0%.

Однократная инъекция ПГF_2α в шейку матки овец за 1 час до искусственного осеменения способствует лучшему продвижению спермы в их половых путях [159].

Gameik P. с соавторами [203] отмечают, что парентеральное введение эстрофана непосредственно перед осеменением глубокозамороженным семенем, повышает плодовитость овец на 15-18% по сравнению с контролем.

В опытах G.D. Singh, H.C. Pant [340] внутримышечные инъекции по 10 мл ПГF_2α четырем баранам за 1 час до получения семени дважды в неделю в течение 20 дней способствовали увеличению спермопродукции.

Широко применяют простагландины для синхронизации отёлов, опоросов окотов.

С целью синхронизации отёлов в опыте на 18 нетелях использовали энзапрост, отёлы проходили через 38 часов после обработки в сжатый промежуток времени на 279 день стельности [177].

При обработке коров клопрастенолом в последние три недели беременности роды наступают между 36 и 48 часами [243].

Также автором отмечается, что рождается нормальный приплод, но у более половины коров при индуцированных родах наблюдается задержание последа.

При этом состояние здоровья, удой и оплодотворяемость не ухудшаются. Для стимуляции родов у овец простагландины, вводят в дозе 15 мг, начиная, со 149-го дня беременности [287], а двукратная инъекция клопрастенола 100 мкг и 50 мкг через 10 часов вызывала роды через 36±1 час. Все козлята родились живыми и выжили до отъёма [370].

В своих исследованиях авторы используют различные синтетические аналоги простагландина F_2α, разных фирм производителей, при этом отмечается одинаковая высокая эффективность [341; 317]. Использование простагландинов в животноводстве представляет собой ценный биотехнический прием. Тем не менее, несмотря на их высокую эффективность в синхронизации половой циклики,

требуется дальнейшее углубление исследований для повышения синхронности овуляций, улучшения оплодотворяемости.

Требуется разработка приемов использования ПГ для коров и телок с нарушением половой функции.

6.2. Современные представления о роли ПГ в механизме овуляции

В последние годы огромное внимание исследователей сосредоточено на методах контролирования овуляции.

Разработка методов управления овуляцией позволит проводить осеменение в запланированное время.

В последние годы получено много данных, говорящих о непосредственном участии простагландинов в созревании и в овуляции фолликулов, а также в оплодотворении.

В исследованиях, проведённых на морских свинках, установлено, что в фолликулах присутствуют рецепторы простагландина F_2α, которые в норме участвуют в развитии самих фолликулов [355].

Инъекция ПГ в преоптическую область переднего гипоталамуса через 15-20 минут вызывает выделение ЛГ в кровь [296].

Инъекция ПГF_2α коровам и овцам на 4-5 день полового цикла способствует росту и созреванию неатретических третичных фолликулов [200; 373].

Содержание ПГF_2α в фолликулярной жидкости перед овуляцией увеличивается [149; 288; 140].

Shimada K. с соавторами [333] сообщают, что за час до овуляции в периферической плазме крови у кур достоверно увеличивается концентрация ПГF_2α.

Максимальная концентрация ПГ обнаружена в самом крупном фолликуле, который и является главным местом синтеза и высвобождения ПГ в яичнике.

Фолликулярные простагландины могут принимать участие в разрыве стенки фолликула и выделении ооцита.

Установлено, что повышение концентрации ЛГ вызывает волну ПГЕ₂ в яичнике, непосредственно после чего происходит овуляция [165]. Espey L.L. [192] в механизме овуляции центральную роль отводит простагландинам, как медиаторам физиологической воспалительной реакции.

MurdochW.J. с соавторами [289] на основании изучения предовуляторных изменений содержания простагландинов Е и F_2α в фолликулах яичника овец, подтверждают гипотезу Espey L.

К аналогичным выводам приводят и данные других исследователей.

Так, овуляция не происходит у животных, которым инъецировали индометацин (ингибитор синтеза простагландинов), даже при последующих инъекциях экзогенных ЛГ или Гн-РГ [142].

Watson E.D., Harwood D.J. [372] на основании неоднократных ректальных обследований и определения гормонального статуса у коров, у которых длительное время (более 60 дней) не происходила овуляция, полагают, что причиной неспособности к овуляции является нарушение синтеза простагландинов в яичниках.

Инъекция ПГF_2α коровам после осеменения в синхронизированную охоту, повысила оплодотворяемость на 9,6% [283]. Аналогичные данные получены и другими исследователями [206].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопленные в последние годы физиологические данные по нейрогуморальной регуляции функции воспроизведения у животных, а также достижения фармакологической промышленности дали возможность направленно воздействовать на все звенья системы гипоталамус – гипофиз – яичники – матка.

Метод направленного регулирования половой функции животных из лабораторного превратился в ценный биотехнический прием, способствующий рациональной организации воспроизводства и увеличению продуктов животноводства.

Хотя исследования по направленной регуляции размножения сельскохозяйственных животных имеют 90-летнюю историю и разрешены многие задачи, в настоящее время еще не до конца решена проблема повышения оплодотворяемости при осеменении в синхронизированную охоту.

В настоящее время гормональные препараты успешно применяются для синхронизации охоты и овуляции у сельскохозяйственных животных, повышения многоплодия у овец и коров, и синхронизации опоросов у свиней.

Применяемые в скотоводстве методы синхронизации охоты – это несомненный прогресс в технологии современного животноводства.

Однако эти методы не лишены недостатков. Так, применение гестагенных препаратов требует продолжительного курса воздействия, сроки синхронного наступления охоты и овуляции растягиваются и оплодотворяемость после осеменения в синхронную охоту низкая.

С открытием ключевой роли простагландина F_2α в лютеолизе, гонадотропин рилизинг-гормона в вызывании овуляции и разработкой методов их химического синтеза появились новые возможности управления процессом воспроизводства у сельскохозяйственных животных.

Несмотря на высокую их эффективность в синхронизации полового цикла требуются дальнейшие исследования для повышения эффективности метода в частности, улучшения оплодотворяемости.

ГЛАВА VII. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ДЛЯ СИНХНОНИЗАЦИИ ОХОТЫ, ОВУЛЯЦИИ И КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ ТЕЛОК И КОРОВ

ГЛАВА VII. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ДЛЯ СИНХНОНИЗАЦИИ ОХОТЫ, ОВУЛЯЦИИ И КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ ТЕЛОК И КОРОВ

7.1. Материал и методы исследований

С целью разработки методов использования простагландинов для направленной регуляции и коррекции нарушений функции размножения крупного рогатого скота нами были проведены исследования.

Исследования проводили на комплексе «Кутьино» по направленному выращиванию нетелей опытного хозяйства «Щапово» Всероссийского научно-исследовательского института животноводства и в республике Башкортостан. Опытное хозяйство «Щапово» Подольского района Московской области организовано в 1962 году на базе мелких хозяйств. Содержание телок на комплексе «Кутьино» беспривязное, кормление групповое. Корма подаются ленточным транспортером. Концентрированные корма раздаются в смеси с сочными.

В зимне-стойловый период рацион телок случного возраста состоял из 11 кг силоса, 6 кг сенажа, 5 кг сена, 2,5 кг комбикорма, 0,3 л патоки, 60 г соли и 60 г меда.

В летний период вместо грубых и сочных кормов в рацион включали 35 кг зеленой массы.

Исследования в РБ проводили в агрофирмах «Мормылево» Уфимского района, ГУСП «Тавакан» Кургачинского района, агрофирме «Родина» Гафурийского района и ОПХ «Баймакское» Баймакского района.

В первых трех предприятиях содержат коров симментальской породы отечественной селекции, в ОПХ «Баймакское» – зарубежной и отечественной.

Крупный рогатый скот размещен в хорошо оборудованных помещениях с полной механизацией трудоемких процессов. Тип содержания животных привязной.

Комплексы работают по технологии ВГНИИЖа – щелевые полы, подпольное хранение навоза, доение в доильном зале на установке «Тандем», ленточная раздача кормов, приготовленных в кормоцехах в виде мешанок, отёлы в родильных отделениях.

В период лактации животные во всех хозяйст­вах пользовались моционом на выгульных площадках. В сухостойный период животные прогулками и активным моционом были обеспечены.

Кормление животных осуществляли по общепринятым нормам. Корма подвергали химическому анализу для определения содержания перечня необходимых питательных веществ, их количества, соотношений и пригодности к скармливанию.

Таблица 1

Биохимические показатели крови

* - Р<0,05;

** - Р<0,01

Биохимическими исследованиями крови установлено, что показатели содержания каротина, общего белка, неорганического фосфора, сахара и щелочного резерва не выходят за пределы нижних, а кальция и кетоновых тел верхних границ физиологической нормы (табл.1).

Обеспеченность по общей питательной ценности колебалась в пределах 98,4 – 102,1%, кальцию – 100,0 – 119,9%, фосфору – 98,6 – 103,4%, сахару – 98,3 – 101,9%, каротину – 97,8 – 100,0%. Соотношение кальция к фосфору находилось в пределах 1,5 : 2,1, а сахара и протеина – 0,7 : 0,9.

Анализ приводимых данных аргументировал правомочность проведения научно-исследовательских работ в этих хозяйствах.

Для исследования были использованы телки черно-пестрой породы предслучного (14-16 мес.) и случного (16-18 мес.) возраста и коровы симментальской породы с продуктивностью от 3,5 до 5,6 тыс. кг молока за лактацию (рис. 1-2).

Для опытов отбирали клинически здоровых животных – аналогов по возрасту и массе тела.

Размер групп для лабораторных опытов составлял 3-14, для научно-производственных – 20-47 голов.

Учитывали следующие показатели: сроки формирования групп, дату гормональной обработки, синхронность прихода в охоту, количество перегулов и даты осеменений, а также оплодотворяемость от осеменения в первый и второй цикл, число абортировавших животных, продолжительность стельности, количество бычков и телочек в потомстве и число мертворождений.

Все поголовье, сосредоточенное на комплексах, мечено ушными выщипали, полиэтиленовыми бирками и ошейниками с номерами.

Все сведения о подопытных животных заносили в специальный журнал. Учет велся индивидуально по каждому животному.

Телок в охоте выбирали с 6 до 9 и с 15 до 18 часов на выгульных площадках визуальными наблюдениями.

Основным признаком охоты считали рефлекс неподвижности и состояние наружных половых органов. Течку определяли по выделению слизи из половых органов.

Первое осеменение проводили непосредственно после выборки телок в охоте. Перед осеменением и гормональным воздействием ректально обследовали состояние половых органов у телок.

При описании пользовались следующими символами:

- матка (в норме, ригидная, атоничная, слаборазвитая);

- ф – фолликулы, хорошо пальпируемые;

- жт₁ – желтое тело мягкое, в стадии образования (1-го – 6-й дни цикла);

- жт₂ – желтое тело отчетливо выступает над поверхностью яичника, имеет твердоэластичную консистенцию, в стадии максимального развития (7-го – 14 дни цикла);

- жт₃ – желтое тело хорошо пальпируемое, консистенция дряблая, в стадии регрессии (15 – 18-й дни цикла);

- ст. жт. – желтое тело предыдущего полового цикла, слабо прощупываемое.

Осеменяли телок в пункте искусственного осеменения, ректоцервикальным методом.

Сперму получали с Центральной станции искусственного осеменения, с содержанием 50-75% млн спермиев в дозе.

Осеменение телок двукратное с интервалом 10-12 часов.

После осеменения телок выдерживали на пункте 10-12 часов, затем перегоняли в секции накопители, где за ними вели наблюдение.

О произошедшей овуляции при ректальном обследовании судили по наличию овуляционной ямки на месте лопнувшего фолликула, а также по наличию желтых тел через 7-10 дней после осеменения.

Через 45-60 дней телок, не пришедших в охоту после осеменения, ректально обследовали на наличие стельности.

В опытах использовали следующие простагландины и их аналоги:

1. Эстрофан – синтетический аналог простагландина F_2α. Выпускался фармацевтическим объединением «СПОФА» ЧССР в виде бесцветного раствора в ампулах по 2 мл. Содержит 0,25 мг клопростенола (натриевая соль) в 1 мл раствора.

Введение вызывает рассасывание желтых тел. Применяется для синхронизации опоросов у свиноматок, а также при функциональных нарушениях яичников («тихая охота», персистирующие желтые тела, лютеальные кисты), при эндометритах у крупного рогатого скота.

Препарат инъецируется внутримышечно.

Допростон-В-11 – дезоксипростагландин Е1 – синтезирован под руководством доктора химических наук Я.Ф. Фрейманиса в лаборатории простагландинов института органического синтеза АН Латвийской ССР.

Препарат выпускается в ампулах по 5 мл, в 1 мл содержится 5 мг активного вещества в фосфатном буфере, рН раствора 8±0,2. Температура хранения 4⁰С.

Препарат инъецируют внутримышечно.

1. Энзапрост – синтетический простагландин F_2α фирмы «Хиноин» Венгерской Народной Республики. Молекулярная масса – 354,5, эмпирическая формула – С₂₀Н₃₄О₅. Хорошо растворим в спиртах, эфире, тетрагидрофуране, в 0,3 М растворе ацетата натрия, плохо – в воде. Препарат выпускают в ампулах по 5 мл, в водном растворе, содержащем в 1 мл 4,0 мг действующего вещества, 40,8 мг ацетата натрия и 0,1 мл фенола, рН раствора 5,5-6,5.

Энзапрост рекомендуют для вызывания регрессии желтого тела, терапии субинволюции матки у коров и кобыл, вызывания родов у свиней и собак. Препарат инъецируют внутримышечно.

1. Простагландин F_2α отечественного производства – выпускался опытным заводом органического синтеза и биопрепаратов Института химии АН Эстонской ССР в виде соли трис-оксиметил-аминометана. Молекулярная масса 475,6. Температура плавления – 98-99⁰С, выдерживает длительное хранения при 1-4⁰С. Препарат выпускается в ампулах по 5 мл в виде бесцветного водного раствора с добавлением в качестве консерванта 0,9% бензилового спирта, рН раствора 8,0. В ампуле содержится 25 мг ПГF_2α.

Препарат инъецируют внутримышечно.

1. Лютализ-простин F_2α (динопрост) – препарат простагландина F_2α в форме кристаллической соли ТНАМ (трометамин) фирмы Апджон США. Молекулярный вес – 457,60. Белый кристаллической порошок, растворимый в воде при комнатной температуре до концентрации 200 мг/мл.

Выпускается в форме стерильного водного раствора 6 мг/мл, содержащего 0,9% бензилового спирта в качестве консерванта.

Раствор хранится 6 месяцев при комнатной температуре.

1. Анипрост – синтетический аналог ПГF_2α, синтезирован в 1984 году в ВНПО «Витамины». В отличие от зарубежных аналогов данный препарат содержит только l-изомеры.

Выпускается в ампулах по 2 мл в виде бесцветного водного раствора, в 1 мл содержится 125 мкг действующего начала.

1. Эстуфалат – синтетический аналог простагландина F_2α. Синтезирован в 1985 году институтами Химии Академии наук Эстонской ССР, Органической химии АН Латвийской ССР и Химии Башкирского филиала АН СССР.

Препарат выпускается в ампулах по 2 мл в виде бесцветного водного раствора, в 1 мл содержится 250 мкг действующего начала.

Лабораторные исследования

В лабораторных опытах в сыворотке крови радиоиммуно-логическим методом определяли содержание прогестерона.

Динамика прогестерона изучалась для определения оптимальной дозы анипроста и для сравнения эффективности использования анипроста и других аналогов ПГF_2α.

Содержание прогестерона в плазме крови определяли в отделе эндокринологии сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

В этих опытах пробы крови у телок брали с 8 по 12 день полового цикла, перед введением препаратов, а также через 24, 48 и 72 часа после инъекции. В каждом опыте было по 4-9 групп в каждой группе от 3 до 14 телок.

Часть животных была обработана дважды, в первый и во второй цикл. Нами были проведены опыты по изучению гормональной активности желтого тела и дальнейшей воспроизводительной способности телок после многократной обработки простагландинами.

Схемы отдельных опытов и условия их проведения приведены при описании их результатов.

Радиоиммунологический анализ

Изучение гормональных взаимоотношений и роли отдельных гормонов в регуляции репродуктивной функции требует количест-венной оценки гормонов в тканях и биологических жидкостях.

Первые (биологические) методы определения содержания гормонов основывались на увеличении массы или на изменениях в тканях и органах лабораторных животных.

Эти методы очень трудоемки, недостаточно специфичны и недостаточно чувствительны.

На смену биологическим методам пришли методы связывания.

В них определение количества гормона производилось на постепенном насыщении специфического связывающего агента гормоном и последующем измерении его распределения между «свободной» и «связанной» фазами.

Одним из таких методов является радиоиммунологический.

Радиоиммунологический метод впервые был предложен для определения эндогенного инсулина в плазме крови человека.

Главное отличие радиоиммунологического метода от биологического состоит в том, что о количестве анализируемого вещества судят, не по его биологической (функциональной) активности, а по количеству комплекса, образовавшегося при взаимодействии этого вещества с так называемым агентом.

К преимуществам радиоиммунологического метода определения гормонов относятся: высокая чувствительность (до 10^-9-10^-12 г/мл гормона), специфичность, надежность, точность, простота и высокая производительность, он позволяет определить содержание в биологических жидкостях не только гормонов, но и ферментов, рецепторных белков и ряда лекарственных веществ.

В радиоиммунологическом методе используется комбинация двух веществ, одно из которых называют связывающим агентом, а другое (количество которого измеряют) – лигандом [122]. Радиоиммунологический метод основан на законе действия масс, в соответствии с которым определяемое вещество будет конкури-ровать со своим меченым аналогом (антигеном) за ограниченное число связывающих мест до достижения химического равновесия всех компонентов реакционной смеси [114].

В каждую пробирку с исследуемым образцом добавляют одинаковое количество антител и меченого гормона.

Чем больше определяемого гормона в образце, тем большее количество антител будет связано с немеченым гормоном и тем меньше будет радиоактивность комплекса гормон-антитело.

Сравнивая радиоактивность комплекса гормон-антитело и радиоактивность его в серии пробирок с известными стандартными разведениями определенного гормона можно судить о количестве гормона в исследуемом образце.

В своих исследованиях мы пользовались готовыми наборами реактивов для радиоиммунологического определения прогестерона в сыворотке крови человека «СТЕРОН-П¹²⁵I», которых выпускал институт биоорганической химии АН Белорусской ССР [106].

В набор «СТЕРОН-П¹²⁵I» входят:

1. Йод-125-прогестерон, 100 кбк (килобеккерель);
2. – 6 калибровочных проб сыворотки крови, с концентрацией прогестерона от 0 до 100 нмоль/л;
3. – концентрированный буферный раствор, рН 3,8, 10 мл;
4. – антисыворотка к прогестерону;
5. – суспензия активированного угля, покрытого декстраном,

10 мл.

Реактивы поставляются в лиофилизированном виде (кроме активированного угля). Набор рассчитан на проведение анализа 43 неизвестных и 6 калибровочных проб в дубликатах.

Анализ состоял из следующих этапов:

а) во флаконы с меченым прогестероном и антисывороткой добавляли по 11 мл буферного раствора, каждый флакон с извест-ной концентрацией прогестерона – по 1 мл, а на каждую 0,1 мл пробу анализируемой сыворотки по 0,5 мл тщательно перемешивали;

б) после переноса активированного угля в стакан емкостью 100 мл и добавления 50 мл дистиллированной воды, помещали его на магнитную мешалку, а в чистые пробирки, обозначенные № 1-16, разливали по 0,1 мл прогестерона с известной концентрацией;

в) внесли по 0,1 мл раствора, разбавленного буфером пробы анализируемой сыворотки, в аналитические пробирки, обозначенные № 17-102, затем во все пробирки разлили по 0,1 мл антисыворотки, все пробирки встряхнули на вихревом смесителе;

г) после добавления 0,1 мл меченого прогестерона и тщатель-ного перемешивания проводили 2-х часовую инкубацию при комнатной температуре и 15-минутную в ледяной бане при 0-4⁰С;

д) в каждую пробирку приливали по 0,5 мл раствора активированного угля и выдерживали 10 минут в ледяной бане периодически перемешивая;

е) все пробирки центрифугировали при ускорении 1500-2000 об/мин в течение 10 минут, после чего с каждой пробирки отобрали по 0,5 мл над осадочной жидкости и переносили в пробирки для счета.

Всех пробирок поместили в гамма-счетчик РИА-300 американской фирмы «Тракор Аналитик». Гамма счетчик имеет цифровой калькулятор и телетайп.

Радиоактивность, выраженная в импульсах в минуту, набиралась цифровым калькулятором против соответствующей концентрации прогестерона и по полученным точкам строилась калибровочная кривая.

Путем сравнения со стандартом и с калибровочной кривой счет каждого образца преобразуется в концентрацию гормона в миллилитре.

7.2. Результаты собственных исследований

7.2.1. Определение эффективной дозы отечественного аналога ПГF_2α - анипроста

Перевод животноводства на промышленную основу требует применения прогрессивных методов разведения.

Возникает необходимость подчинить репродуктивные процессы коров и телок технологическим циклам производства, календарного регламентирования прихода в охоту, овуляции и оплодотворения для ритмизации последующих производственных циклов – запуска, отела, выращивания молодняка и др.

В последние годы для направленной регуляции репродуктивной функции самок сельскохозяйственных животных практическое применение нашли ПГF_2α и его синтетические аналоги, которые вызывают быстрый лизис желтого тела с последующей овуляцией.

В 1984 году ВНПО «Витамины» синтезировало новый препарат простагландина – анипрост. В отличие от зарубежных аналогов данный препарат содержит только α – изомеры.

Целью наших опытов в разделе 7.2.1. было испытание данного препарата в лабораторных и научно-производственных опытах на телках предслучного и случного возраста, основной задачей было определение эффективной дозы анипроста.