рс ареды с ипермыд олжнб аыто ьдинаково( й27 � 1 � С .)Длэ ятог опосуд у с о средо й храня т в термостат е ил и н а подогреваемо й магнитно й мешалк .е Чере з 15–2 0 ми н посл е предварительног о разбавлени я проводя т финально е разбавлени е пр и температур е 18–20 � С . Разбавляю т спермт уач ,ктобы в дозс епермы посло еттаиванис яодержалос1 ь0–1 5 млп .нодвижныс хперматозоидо.в Пр и разбавлени и использую т шпри ц непрерывног о действи .я Ра-з бавляю т сперм у средо й постепенн .о Дл я этог о сред у приливаю т к предварительн о разбавленно й сперм е небольшим и порциям и в полиэтиленовы й спермоприемни ,к осторожн о смешиваю т посл е добавл-е ник яаждо йпорции среды . Пр и использовани и градуированног о смесител я разбавленную в спермоприемник ес 1:1перм убык апереливаю т с вмесител ь инебольшим ипорциям ипс отенкд еобавляюс тред .уПослд еобавленик яаждо й порци и смесител ь наклоняют та ,к чтобы сперм а оставалас ь вниз у ег о расширенноч йастив ;ращас ямесителс ,ьмешиваюс тперм .у Современны е технологи и предусматриваю т автоматизированно е разбавленис епермык с онтролемт емпературы в иыборомс тепенр иа-з бавлени я с учетом подвижност и и концентраци и сперматозоидо в в сперм,е т аакжк еоличеств аподвижныс хперматозоидод в воз( епайет )е дло ясеменени .я Пр и использовани и двухфракционны х сре д ЖЦГ и ЦЛЖГ пере д разбавлением спермы буфе р подогреваю т д о 33...25 � С , разделяю т н а дв е фракци ,и добавляю т в каждую и з ни х необходимо е количеств о желтк аг илицерин( а вфракцию Б .)В фракцию Ав нося ти зрасчет ан а кажды й миллилит р среды 10 0 мк г тилозин ,а 50 0 мкг гентамицин а и 306/00 0мкл гинкоспектинр ,аастворенны0,0 в х 2мб лидистиллированно й стерильно й воды . Весовы е количеств а антибиотико в необходим о приводит ь в соответстви е с и х активностью , котора я може т различатьс я з вависимост и о т парти и препарат .а Вс е антибиотик и должны быт ьпроверены нб аезвредностд ьлс яперматозоидо .вГентомици н и о тилози н могу т сохранятьс я в раствор е пр и 5 С т вечени е 8 дне ,й а в пара хжидкога озот а– д 6 омесяце.в Сначал аи зполученног оо ицененног опв онешнимс войствамэ якулят а беру т пробы дл я определени я подвижност и и концентраци и сперматозоидо в в сперм .е Есл и эякуля т пригоде н дл я использовани ,я т о проводитс я санаци я неразбавленно й спермы . В спермоприемни к внося т пипеточным дозатором смес ь антибиотико .в Н а кажды й миллилит р спермы добавляю т 0,0 2м л раствор ,а в котором содержитс я 10 0мкт гилозин ,а50 0мкг гентамицин а и306/00 0мк глинкоспектин .а Посл еосторожногс омешиванис япермв уыдерживаю т 5ми нпрт иемператур3 е0 � Сз ,атеме о ецениваю тпп оодвижностс иперматозоидо .в Есл ииспользуетс яполигет ,но ов нноситс в янеобходимык холич-е ствао в хб ефракцис ирес в а ,дпермн уд еобавляетс.я
Посл е выдержк и в течени е 5 ми н сперм у разбавляю т фракцие й А ЖЦГ ил и ЦЛЖГ-среды . Сред у приливаю т аккуратн о и медленн о в спермоприемни( кил и п о стенкам стеклянног о смесител я с о спермой ) в оизбежанис еильны хотрицательны хосмотически х явлени .йЭт а н е содержащаг ялицерин а фракци я добавляетс я и з расчет ,а чтобы объем спермы и среды состави л половинз уапланированног о объем а разбавленнос йпермы с( учетом получени в яодном миллилитр е20 0миллионос вперматозоидов .)Температурс апермыс и реды – 30°C . Предварительн о разбавленна я фракцие й А сперм а помещаетс я в холодильни к иохлаждаетст в яечени е 2 чд о5 � С .Длт яог очтобы охлаждени е проходил о равномерн ,о колб у с разбавленно й спермо й помещаю т в стака н с водо ,й температур а которо й – 30°C . Фракцию Б среды , содержащую глицери ,н такж е помещают в холодильни ,к гд е он а охлаждаетс я д о момент а использовани .я Эт а фракци я може т содержат ь5–10% концентрациа интибиотико ,вопределенно йдл яфракци иА . Чере ч 2 значинаетсв ятороэ йтар пазбавленис япермы .В предварительн оразбавленную фракцие йАс перм увнося тохлажденнуюг лиц-е риновую фракцию Бс в оотношени и к .е .т ,1:1одном уобъем уразбавленнос йпермы прибавляю травны йобъем охлажденно( йд о5°Cс )р-е ды .Фракцию Бв нося тнс еразд а ,уеля тнт арр иавныч еаст и иприбавляю т чере з 10–15-минутны е интервалы медленн о и постепенн .о Это т эта празбавлени я производитс я в холодильник епрт иемператур е5°C н апротяжени и30–4 5ми .нПосл ефинальног оразбавлени я в 1м лра-з бавленнос йпермыд олжнс оодержатьс1 я0 0млс .нперматозоидо.в Посл е завершени я разбавлени я сперм у расфасовываю т в пайеты , которы еразмещаю в тпланшеты .В каждо йпайет едолжнс оодержатьс2 я 5млс .нперматозоидо.в Есл ирасфасовываюс тпермг в уранула( х 2,0млт ,)огд апосл ефинальног оразбавлени яфракцие йБ в 1мс лпермы должнс оодержатьс я 12 5млс .нперматозоидо.в Дл ядостижени я выравнивани яконцентрациг илицерин с анаружно й и внутренне й сторо н клеточно й мембраны достаточн о 4 ( чврем я эквилибрации .)Вт ечениэ етог овремен иокончательн оразбавленную спермв уыдерживаю тпрт иемператур е5°Cз а ,атемз амораживаю тп о стандартнот йехнологи .и Сперм убык аразбавляю с трасчетом получени я1 0– 1 5млс .нперматозоидо в с прямолинейно-поступательным движением пр и подвижност и н е мене е 4 балло .в Дл я расчет а степен и разбавлени я и-с пользую тформулу
С � А � V
Р = --------------- ,
0,01 0 � 1 0
гд еР – количествр оазбавителд ял 1 ямс лпермы; С – концентрацис яперматозоидос в вперм ,емлр .дм;л А – подвижностс ьперматозоидоп вослр еазмораживани( яб 4алл;)а V – объемд озыс пермы ,м.л 0,01 0– подвижны хсперматозоидод в воз ,емлр.д 1 0– перевоб далло( в4к в )оличествп оодвижныс хперматозоидо.в Разбавленис епермыб аранк и аозла . Посл е получени я сперм у постепенн оохлаждаю тд о25–30 � С .В момен тразбавленис яперм ас ир-е д а должны имет ь одинаковую температур .у Разбавляю т сперм у в спермоприемник .е Н а 1 м л спермы добавляю т 1– 2 м л среды . Охлаждаю тразбавленнуюс перм упостепенн од о2–4 � Ст в ечени е2– 3 .чЖ-е лательн офлаконыс с опермо йпоместит в ьхимическис йтакав с нодо й температуры2 5–30 � Сп и оместитх в ьолодильни кнч 2 аас.а Пр и использовани и сре д длз яамораживани я и длительног о хран-е ни япосл еполученис яперм увыдерживаю тн еболе е1 5ми .нСредо й ВИКА разбавляю в тоди нприемс в оотношени и 2:1прк ионцентраци и сперматозоидо в 5,2– 3,3 млр .д в м л и 3:1 пр и концентраци и и х выш е 3,3 млр .д в м .л Средт( уемпературы 30 � С ) добавляю т в сперм у осторожнп ос отенкамс пермоприемник.а Пр и использовани и ЛЖГТЦГ-среды сперм у разбавляю т в дв а прием :а сначал а ЛЖ-средо й в соотношени и 5,0:1 пр и температур е 28 � 2 � Сз а ,атем добавляю тоди нобъем ЛЖГТЦГ-среды прт иемп-е ратур2 е0 � 2 � С . ГЖУК- трис-буфернос йредос йвежеполученнуюс перм уразбавляю в тоди нприемс в оотношени и 3:1прк ионцентрацис иперматозоидо3 в– 4млр в .дмп 4:1 и лрк ионцентрации ис хвыш 4 емлр в .дм.л Спермк уозла разбавляю5 в т–2р 0а .зИо здногэ оякулят аможн ополучит ьд4 од 0о в а ,знеделюо о тдногс оамцв ав орем яполовогс оезон а– д3 о0д 0о.з Разбавленис епермых ряка .Посл еполученис япермв уыдерживаю т т вечени2 е0–3 0ми нпрк иомнатнот йемператур ер иазбавляю т2 в–1 0 ра .зВ неразбавленнос йперм едолжнс оодержатьс ян е мене е10 0мл .н сперматозоидо ,вподвижност ь– н ениж е 7балло .вВ одно йдоз еобъемом1 0 0мд лолжнб оыт 5,2 ьмлрп .додвижныс хперматозоидо.в Приме ррасчетк аоличеств адо зк иоличеств аразбавител .яПроцен т сперматозоидо в с нормально й подвижностью – 70%( 7,0 ,) концентр-а ци я– 13 4миллион 1 в ам ,лмассэ аякулят а– 23 .г 3 Количествд оо з– 231,0 · 33 5,2 : 7,0 · 4=д 8 о .з 1 · 80 0– 23 3=5 6 7мр лазбавител.я Разбавленис епермы жеребца .Разбавляю тсперме ,услк ионцентр-а цис яперматозоидо вн емене е15 0мл в .нм л иподвижност ьн ениж е 6 балло .в Степен ь разбавлени я – 2:1 – .3:1 Сред у приливаю т к сперм е
