пригоден для дальнейших исследований. Поэтому необходимо соблюдать общие
правила фиксации, контролировать качество реагентов для фиксирующих раство
ров. Кроме того, нужно заранее знать предполагаемые методы исследования и вид
ткани, т.к. от этого будет зависеть выбор фиксирующей жидкости и продолжи
тельность фиксации.
Фиксируемые ткани претерпевают ряд физико-химических изменений.
Наиболее существенными из них являются: быстрое свертывание белков и ча
стично липидов и переход их в такое состояние, при котором ткани не изменяются
от длительного хранения и во время последующих обработок.
• возможно выпадение формалиновых осадков, которые образуются в
результате взаимодействия формальдегида с гемоглобином.
Фиксация кальций-формолом по Бейкеру. Данный раствор используется
для фиксации липидов при подготовке к исследованию жировой ткани [4].
Приготовление раствора:
А. 10 мл 40% формалина + 90 мл дистиллированной воды.
Б. 1 г хлорида кальция.
Растворы А и Б смешивают.
Продолжительность фиксации - 24-48 ч. при комнатной температуре.
Можно сначала делать гистосрезы из нефиксированных проб тканей, а затем помещать их в фиксирующую жидкость, т.к. без обезвоживания не получится провести окраску срезов.
Если планируется готовить гистосрезы только из рогового чехла копытца или проба тканей содержит роговой слой, то фиксацию проводить не следует, т.к. структура рогового башмака становится еще плотнее и это значительно затрудняет или делает невозможным приготовление гистопрепаратов. Копытцевый рог или пробы тканей, содержащие его, сразу погружаются в специальный раствор для декальцинации, который, как правило, уже содержит формалин, и в свою очередь, препятствует аутолизу мягких тканей.
После фиксации и уплотнения ткани тем или иным способом готовят гистосрезы. Для получения тонких срезов одинаковой толщины, пригодных для микроскопического исследования, пользуются аппаратами - микротомами.
-
Замораживание ткани. При изготовлении гистологических препаратов на кри-
-
отоме применяют жидкую среду: специальный криогель или воду. Этот метод имеет ряд преимуществ:
-
✓ позволяет быстро изготовить гистологические препараты; ✓ различная толщина (от 1 до 150 мкм) гистосрезов;
✓ используется при исследовании тканей на отложение в них жира и жиросодержащих веществ, поскольку жиры растворяются в спиртах, ксилоле и ацетоне (необходимые компоненты при заливке тканей в парафин);
✓ удобно использовать для плотных тканей, например, рогового чехла. При заморозке копытцевого рога или проб тканей, содержащих его, температура в микротоме может быть -10-12°С, т.е. достаточно лишь зафиксировать пробу ткани на столике, дополнительного уплотнения она не требует. При заморозке проб, содержащих жировую ткань, температура микротома должна быть ниже -28-30°С. Это необходимо для дополнительного уплотнения ткани. При более низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится.
лее низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится. Заливка ткани в парафин. Мы использовали стандартные методики, описанные в литературе [2, 3, 4, 5]. Данную методику можно использовать для небольших фрагментов мягких тканей (например, грануляционной ткани). Очень удобны в использовании и значительно ускоряют работу аппараты для проводки и заливки в парафин. Срез должен получиться достаточно тонким и прозрачным, чтобы быть пригодным для окрашивания и микроскопирования. Обычно готовят срезы толщиной от 4 до 15 мкм. Но есть и исключения: • роговой чехол - 2-4 мкм; • мякиш с большим количеством жировой ткани - 20-40 мкм; • срез, включающий ткани различной плотности - 8-10 мкм. Предметные стекла, применяемые для гистологических препаратов, как правило, специально упакованы и уже готовы к использованию. Но иногда гистосрез необходимо дополнительно фиксировать на предметном стекле, например, срезы рогового чехла или срезы, включающие в себя ткани разной плотности. Для этого пользуются одним из способов: ^ стекла окунают в раствор желатина и калиево-хромовых квасцов, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Приготовлениераствора (0,5 л готового раствора): 0,5 л воды, 2 г калиевохромовых квасцов, 2,5-4 г желатина. Калиево-хромовые квасцы растворить в воде, подогретой до 40-50°. Желатин полностью растворить в горячей воде (смотрите инструкцию на упаковке желатина). Смешать оба теплых раствора и обмакнуть в него предметные стекла. Недостаток данного способа: чаще всего происходит окрашивание фона под препаратом. Это затрудняет выделение тканей с совпадающим по тону цветом при использовании компьютерных программ, но, как правило, практически не мешает морфометрии. ^ свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка [2, 3]. Недостаток метода: окрашивание фона под препаратом. ^ готовые адгезивные препараты, которые улучшают прикрепление среза к предметному стеклу, не влияют на реакции окрашивания и не создают фона. Препараты улучшают адгезию также и в методиках, где используется нагревание. К недостаткам можно отнести высокую стоимость препарата.
